Alimento con efecto de confusión e inmumomodulador para salmones infestados con Caligus rogercresseyi

Introducción.

Caligus rogercresseyi es un copépodo ectopárasito causante de importantes pérdidas económicas en la salmonicultura chilena (Bravo, 2003). Las especies más susceptible a esta infestación son el salmón Atlántico (Salmo salar) y la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) (Gonzalez y col., 2000). C. rogercresseyi presenta un sistema quimiosensor complejo para identificar señales químicas emitidas por el hospedero. Esta capacidad quimiosensora le permite al parásito diferenciar especies hospederas susceptibles y especies no hospederas (Ingvarsdóttir y col., 2002, Bailey y col., 2006, Pino-Marambio y col., 2007). Estas señales son vitales para los procesos de búsqueda y localización de hospederos; proceso bien estudiado en sistemas terrestres, donde insectos plagas captan los olores de plantas susceptibles para ser infestadas (Bruce y col., 2005). Una vez que el parasito localiza, identifica e infesta a su hospedero, se inicia una combinación de procesos fisiológicos en el pez, para contrarrestar el efecto inmunosupresor que causa el parasito (Fast y col., 2006, 2007).

Distintas especies de plantas emiten una serie de compuestos con diferentes propiedades. Muchos de estos compuestos han sido identificados como compuestos bioactivos capaces de controlar la infestación de insectos parásitos (Gillij y col., 2008, Nyasembe y Torto, 2014) y son usados para interferir con la conducta de los parásitos que buscan su hospedero (Thiery y Visser, 1986). En el caso de Caligus rogercresseyi, se determinó que algunos compuestos naturales extraídos de vegetales, son capaces de enmascarar las señales químicas emitidas por el salmón Atlántico (Bailey y col., 2006, Pino-Marambio y col., 2007). En estudios de laboratorio, la adición de estos compuestos en agua acondicionada de salmón Atlántico originó una conducta de rechazo, inhibiendo la preferencia de los parásitos por los atractantes liberados por el hospedero (Figura 1).

La validación de estos ensayos de laboratorio in-vitro, indicaron que al adicionar estos compuestos al alimento, se logra una reducción de la carga de parásitos de hasta un 42% en tres dosis evaluadas (Figura 2).

Estos compuestos también tienen capacidad inmunomoduladora, capaces de potenciar la respuesta inmune del hospedero (Tsimidou y col., 1995, Anthony y col., 2005, Koch y col., 2008, Bakkali y col., 2008).

Luego de evaluar el efecto de estos productos anticaligus en condiciones de estanque, se planteó el objetivo de evaluar el efecto de estos aditivos funcionales, derivados de plantas capaces de confundir o interferir el proceso de localización de hospederos del copepodito de Caligus rogrecresseyi, durante infestaciones en condiciones normales de producción comercial. Además de evaluar la eficacia de estos compuestos, también se evaluaron las propiedades inmunomoduladoras de la respuesta inmune en los peces alimentados con la dieta funcional.

Estudio de campo.

La dieta funcional anticaligus fue formulada de acuerdo con los estándares de EWOS Chile Alimentos (Tabla 1).

Se alimentó un centro de cultivo ubicado en el sector de Hornopiren, Región de los Lagos, Chile. En el centro se manejan aproximadamente 1.000.000 de peces de la especie salmón Atlántico (Salmo salar). El peso promedio al inicio de la alimentación fue de 250 g. El período de alimentación fue de 20 semanas. El plan de manejo de parásitos en este centro constaba de la aplicación de baños de peróxido de hidrógeno, por centro o por jaula, cuando se superase el valor mínimo permitido de hembras ovígeras (1,5 hembras ovígeras) (Sernapesca, 2015).

Se seleccionaron cuatro jaulas cabeceras para el seguimiento de la carga de parásitos, en cuatro tiempos de muestreo dentro del período de alimentación con la dieta funcional. Los tiempos de muestreo y seguimiento fueron al inicio (semana 1), y a las 4, 12 y 20 semanas post inicio de la alimentación. En cada punto de muestreo se tomaron 30 peces por jaula, los cuales fueron utilizados para el conteo y seguimiento de la carga de parásitos. De estos 30 peces, 20 fueron devueltos a sus respectivas jaulas y diez fueron sacrificados para tomar muetras de piel y riñón anterior para posterior análisis de evaluación de la respuesta inmune (Figura 3).

El seguimiento durante las 20 semanas de aplicación de la dieta funcional anticaligus indica que la carga total de parásitos bajó desde 6,78 hasta 1,37 Caligus en la semana 20 cuando la alimentación con la dieta funcional fue suspendida. Importante fue la reducción alcanzada a las 12 semanas de alimentación donde la carga de parásitos fue de 0,50 Caligus por pez. Esto indica que el manejo integrado entre los tratamientos quimioterapéuticos y tratamientos no farmacológicos se apoyan para mantener la carga de parásitos baja (Science y col., 2002). Es importante destacar que el número de hembras ovígeras se mantuvo por debajo del mínimo permitido por la autoridad durante las 20 semanas de alimentación.

Para la obtención de los datos de la secuenciación masiva, el ARN fue extraído de los tejidos piel y riñón anterior en los cuatro tiempos de muestreo. La extracción fue de acuerdo con los protocolos de un kit de extracción de ARN total (Ambion, Life Technologies, USA). Las muestras biológicas extraídas fueron secuenciadas por el sistema MySeq (plataforma Illumina). La secuenciación fue realizada en el Laboratorio de Biotecnología y Genómica Acuática, en el Centro Interdisciplinario de Investigación en Acuicultura (INCAR) de la Universidad de Concepción, Chile. Los datos de secuenciación fueron comparados entre los datos obtenidos en la semana 1 y los datos obtenidos en las semanas 4, 12 y 20 post alimentación.

Los datos generados por la secuenciación masiva fueron procesados por herramientas bioinformáticas. El transcriptoma del salmón Atlántico alimentado con dieta funcional e infestado con Caligus rogercresseyi muestra un cambio en la expresión de genes. El análisis de cluster mostró valores de expresión de transcripción diferenciales entre los cuatro tiempos de muestreo del período de alimentación. Los perfiles generales de expresión se muestran en la Figura 2.

La expresión de los genes se evalúa a través de una mapeo de calor, donde el color negro indica una baja expresión y desde el rojo y avanzando hasta amarillo, indicando genes sobreexpresados. En uno de los cluster de genes expresados, cambia desde genes menos expresados a genes sobreexpresados (Figura 2A). Desde el inicio de la etapa de alimentación con dieta funcional anticaligus, se observa que la sobreexpresión de los genes va en aumento, indicando que la alimentación influye en expresión de genes y que incrementa la sobrerregulación durante las 20 semanas de administración de la dieta (Figura 4B).

Una lista detallada de los genes identificados relevantes se muestra en la Tablas 3 y 4, para riñón anterior y piel, respectivamente. Una sobreexpresión específica en el riñón anterior se observó para genes como inmunoglobulinas, receptores tipo Toll (TLR) y Complejos de Histocompatilibilidad Mayor (CMH o MHC, acrónimo para el inglés) (Tabla 3). Esto genes están asociados con la respuesta inmune innata (receptores tipo toll), adquirida (MHC) e inmunidad humoral (TLR). Adicionalmente, estos genes están vinculados con una respuesta inflamatoria, proceso de curación de heridas, y proliferación celular. Un incremento en la repuesta sistémica pro-inflamatoria ha sido reportada en las especias más resistentes como es el caso del salmón Coho (Jones y col., 2007).

La sobreexpresión específica observada en la piel fue sustancialmente mayor a la observada en riñón anterior (Tabla 4). Cabe destacar la sobreexpresión de genes de hemoglobina. La producción de hemoglobina podriar estar apoyando el proceso de reparación de heridas. En salmón Atlántico infestado con Lepeophtherius salmonis, genes de hemoglobina bajaron su nivel de expresión en presencia del parásito (Krasnov y col., 2012).

Conclusiones

Como parte del manejo integrado de Caligus del centro evaluado, el uso del alimento funcional más los tratamientos convencionales utilizados, disminuyeron los niveles de infestación de Caligus rogercresseyi durante el período de alimentación, comparado con el inicio de este período.

El análisis de expresión génica diferencial indicó que existen mecanismos sistémicos inflamatorios, de proliferación celular y procesos de reparación de heridas, los cuales pueden ser alterados por el uso de aditivos funcionales, que además de causar una reducción de la carga de parásitos, también podrían incrementar la resistencia del salmón Atlántico a la infestación por Caligus rogercresseyi.

Referencias

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