Criopreservación de semen de salmónidos producidos en Chile: uso de estabilizadores de membrana
Iván Valdebenito1, Andrea Ubilla1, Jennie Risopatrón2, Matías Valdebenito1 y Elías Figueroa1.
1Escuela de Acuicultura, Universidad Católica de Temuco – Chile
2Cebior, Universidad de la Frontera – Chile
Investigación financiada por Proyecto Fondef D10I1064 | ivisler@uct.cl
Introducción
Durante la criopreservación, la incorporación de estabilizadores de membrana plasmática y antioxidantes en los medios crioprotectores, podría complementar la protección de las células espermáticas al criodaño, disminuyendo las alteraciones de la membrana plasmática y la peroxidación lipídica producto de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Lahnsteiner, 2000; Lahnsteiner y col., 2011; Figueroa y col., 2013). En mamíferos, varios estudios indican que el daño de la membrana plasmática y la producción de ROS en la criopreservación de espermatozoides congelados-descongelados disminuye la integridad de la membrana fosfolipídica y los niveles de antioxidantes del semen fresco (Lasso y col., 1994; Basal y col., 2011) generando aumento de sensibilidad a la peroxidación lipídica, que conllevaría a la reducción de la motilidad, viabilidad y tasa de fecundación después de la descongelación.
Recientemente, investigaciones en diferentes especies de peces teleósteos evidencian la importancia de la incorporación de estabilizadores de membrana y antioxidantes a los medios de criopreservación, como yema de huevo (lipovitelinas, fosfovitina y lipoproteínas de baja densidad), albúmina sérica bovina, vitamina E, trolox, tocoferol, selenio y otros, respectivamente (Ciereszko y col., 1999; Lahnsteiner & Mansour, 2010; Cabrita y col., 2010, Figueroa y col., 2013).
Estos componentes mejorarían la motilidad, integridad de la membrana y disminución de la peroxidación de los lípidos de los espermatozoides, teniendo un efecto positivo sobre la capacidad fecundante del semen criopreservado de especies salmonídeas (Lahnsteiner & Mansour, 2010). En la presente investigación, se determinó el estabilizador de membrana espermática que permita mantener altas tasas de fecundación en semen criopreservado de las especies salmonídeas de mayor producción en Chile, como son salmón Atlántico, trucha arcoíris y salmón coho.
Materiales y métodos
Lugar de muestreo
Esta investigación se llevó a cabo en los laboratorios de la Escuela de Acuicultura de la Universidad Católica de Temuco, Chile. Los reproductores de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) con un peso de 3,5±0,3 Kg y longitud de 66±0,6 cm, salmón Atlántico (Salmo salar) con un peso de 5,2±1,4 Kg y longitud de 71±1,3 cm y salmón coho (Oncorhynchus kisutch) con un peso de 4,2±1,1 Kg y longitud de 69±1,6 cm, fueron especímenes sexualmente maduros siendo proporcionados, por las empresas Troutlodge Chile, Salmones Aysén y Aquagen Chile.
Toma de muestras
Semanalmente, se seleccionaron ejemplares sexualmente maduros desde estanques de producción de las pisciculturas señaladas. Para la recolección de espermatozoides, los reproductores fueron anestesiados con anestésico BZ-20 (Veterquímica), según protocolos estándares para la industria. El semen fue recolectado a través de cánula y/o masaje abdominal. Antes de la recolección, se ejerció una ligera presión para eliminar orina en los conductos y el poro urogenital se limpió para eliminar el agua, mucosidad y heces. Las muestras se mantuvieron en contenedores desechables cerrados, con una altura de la columna de semen no superior a 3mm en un soporte de poliestireno, para evitar el contacto directo con el hielo (aproximadamente a 4 °C) y a oscuras, hasta su análisis. Las muestras que se encontraron contaminadas (orina, heces y sangre) fueron descartadas.
Evaluación del semen
Inmediatamente después de la recolección, se evaluó la motilidad y concentración espermática mediante microscopio de contraste de fase (Nikon Eclipse E-400, Japón). La motilidad espermática se activó con Powermilt (Universidad Católica de Temuco, Chile) y se expresó en porcentajes de espermatozoides mótiles de acuerdo con Aas y col., 1991. La concentración espermática se determinó con hemocitómetro de Neubauer. Sólo las muestras que presentaron una motilidad >80% y una concentración superior a 12 x 109 espermatozoides/mL se utilizaron en el estudio según recomendación de Figueroa y col., 2013. Todo el trabajo de laboratorio se efectuó a una temperatura ambiente de 4 ºC.
Protocolos de congelación
La congelación de las muestras de semen se realizó de acuerdo a protocolos establecidos en informes anteriores, con modificaciones. Incorporación del medio Stopmilt en vez del medio Cortland (Figueroa y col., 2014; Ubilla y col., 2014).
Previo a congelación, la mezcla de semen y medio crioprotector fue de 1:2 (10% DMSO y 0,6 M sucrosa, para trucha y salmón Atlántico y 10% DMSO y 0,6M trealosa, para salmón Coho, incorporando estabilizadores de membrana y antioxidantes) mantenido por un tiempo de equilibrio de 10 minutos a , posteriormente fueron introducidas en pajuelas (0,5 mL) y depositadas en un contenedor de poliestireno con nitrógeno líquido (N2L), que en su interior tenía una balsa a una altura de 2 cm de los vapores del nitrógeno líquido, luego de 5 minutos en un nivel específico, las pajuelas fueron sumergidas en nitrógeno líquido a -196 °C y almacenadas durante un mes sumergidas en nitrógeno líquido (Figura 1). Posteriormente, las pajuelas fueron descongeladas a 34 °C por 30s en un baño termorregulado.
Selección del estabilizador de membrana plasmática
Se evaluó el efecto en la función espermática de dos estabilizadores de membrana: yema de huevo y BSA (albumina sérica bovina, fracción V) (Lahnsteiner y col., 2010; Cabrita et at., 2010) a diferentes concentraciones.
La evaluación de la función espermática se realizó por citometría de flujo (potencial de membrana mitocondrial, integridad de la membrana plasmática/ viabilidad y fragmentación del ADN) y la tasa de fecundación se evaluó alrededor de las 10 UTA, identificando los primeros clivajes del disco embrionario (Figura 2).
Análisis estadístico
Los datos (promedio ± desviación estándar) fueron expresados en porcentajes de función. Siendo analizados con el programa estadístico GraphPad Prisma versión 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Se utilizó una Anova para muestras no paramétricas. Además, se realizó el test de Kruskal-Wallis y el post-test de comparaciones múltiples Dunns para evaluar las diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos. El nivel de significancia se fijó en p< 0,05.
Resultados
Tasa de función espermática
Fecundación: Los controles con semen fresco presentaron un porcentaje de fecundación promedio mayor al 85% en las tres especies (trucha arcoíris, salmón Atlántico y salmón Coho). Los mayores porcentajes de fecundación se obtuvieron con 2 y 4% de BSA para trucha arcoíris y salmón Coho (90±3,4%; 81±1,9%, de fecundación, respectivamente), de igual forma con 6% de yema de huevo para salmón Atlántico (91±7,9%), no presentando diferencias estadísticamente significativas con los controles (p>0,05, Figura 3)
Integridad de membrana plasmática: El mayor valor espermático se observó con 2 y 4% de BSA para trucha arcoíris y salmón coho (80±9,2%; 70±7,2%, respectivamente), de igual forma con 6% yema de huevo para salmón del Atlántico (75±8,6%). Estos no presentaron diferencias significativas con los controles (90±5,4%; 86±3,9; 80±3,9%, respectivamente, p > 0,05, Figura 3)
Potencial de membrana mitocondrial: El semen control de trucha arcoíris (87±4,9%), salmón Atlántico (85±8,6%) y salmón coho (88±5,8%), presentaron diferencia estadísticamente significativas con los tratamientos (p<0,05). El mayor valor espermático se observó con 2 y 4% de BSA para trucha arcoíris y salmón coho (63±6,8%; 51±3,6%, respectivamente), de igual forma con 6% yema de huevo para salmón Atlántico (53±9,2%, Figura 3).
Fragmentación del ADN: La menor tasa de fragmentación se observó con 2 y 4% de BSA para trucha arcoíris y salmón coho (5±1,5%; 4±4,1%, respectivamente), de igual forma con 6% yema de huevo para salmón Atlántico (3±3,9%), sin diferencia con los controles (p>0,05, Figura 3).
Conclusiones
Estos resultados preliminares sugieren que el uso de estabilizadores de membrana plasmática en los medios de congelación de semen de especies salmonídeas no presenta diferencias significativas en la tasa de fecundación y otros parámetros de función espermática con respecto al control. Siendo para trucha arcoíris la incorporación de 2% de albumina sérica bovina (BSA), salmón Atlántico con 6% de yema de huevo y salmón coho con 4% de BSA. En todos los ensayos se incorporó Stopmilt al medio de congelación, lo que no presentó diferencias significativas en los parámetros evaluados.
Se sugiere utilizar estabilizadores de membrana plasmática en la congelación in situ de semen de salmónidos, debido a que favorece la tasa de fecundación y parámetros fisiológicos del espermatozoide.
Referencias
Bansal AK, Bilaspuri GS. 2011 Impacts of Oxidative Stress and Antioxidants on Semen Functions. Vet Med Inter, Article ID 686137, 7 pages doi:10.4061/2011/686137.
Cabrita E, Sarasquete C, Martínez-Páramo S, Robles V, Beirao J, Pérez-Cerezales S, Herráez MP. 2010 Cryopreservation of fish sperm: applications and perspectives. J Appl Ichthyol. 26, 623–35.
Ciereszko A, Dabrowski K, Kucharczyk D, Dobosz S, Goryczko K, Glogowski J 1999 The presence of uric acid, an antioxidative substance, in fish seminal plasma. Fish Physiol Biochem; 21, 313–5.
Figueroa E., O. Merino, J. Risopatrón, V. Isachenkod, R. Sánchez, B. Effera, E. Isachenkod, J.G. Farias, I. Valdebenito. 2014. Effect of seminal plasma on Atlantic salmon (Salmo salar) sperm vitrification. Theriogenology. 83(2015): 238-245 Doi:10.1016/j. theriogenology.2014.09.015
Figueroa, E., Risopatrón, J., Sánchez, R., Isachenko, E., Merino, O., Valdebenito, I., Isachenko, V., 2013. Sperm vitrification of sex-reversed rainbow trout (Oncorhynchus mykiss): effect of seminal plasma on physiological parameters. 372 – 375, 119 – 126.
Lahnsteiner F, Mansour N, Kunz F 2011. The effect of antioxidants on the quality of cryopreserved semen in two salmonid fish, the brook trout (Salvelinus fontinalis) and the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Theriogenology 76, 882–890
Lahnsteiner F, Mansour N. A 2010 comparative study on antioxidant systems in semen of species of the Percidae, Salmonidae, Cyprinidae, and Lotidae for improving semen storage techniques. Aquaculture. 307, 130–40.
Lahnsteiner F. 2000 Semen cryopreservation in the Salmonidae and in the Northern pike. Aquaculture Res; 31:245–58.
Lasso JL, Noiles EE, Alvarez JG, Storey BT. 1994 Mechanism of superoxide dismutase loss from human sperm cells during cryopreservation. J Androl. 15, 255– 65.
Ubilla A, D Fornari, E Figueroa, B Effer & I Valdebenito. 2014. Short-term cold storage of the semen of rainbow trout Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792) incorporating DMSO in the sperm diluent. Effects on motility and fertilizing capacity. Aquaculture Research: 1-8. doi:10.1111/are.12458.
