¿Cuándo el bienestar del salmón se ve afectado por C. rogercresseyi?: Determinación de umbrales de parasitosis

Introducción

Caligus rogercresseyi es el ectoparásito más relevante que afecta a la salmonicultura chilena (González y Carvajal, 2003). Este parásito posee un amplio rango de hospederos, desde salmónidos hasta especies nativas del sur de Chile (Marín y col., 2015). El ciclo del vida del parásito incluye ocho estados de desarrollo: las etapas planctónicas nauplius I, II y el copepodito (estadio infestante), seguido de los estadios fijos en el hospedero chalimus (I – IV), y los adultos macho y hembra (González y Carvajal, 2003). En el año 2007, se registraron las más altas cargas de C. rogercresseyi en los salmones de cultivo en Chile, lo que llevó a realizar un esfuerzo conjunto entre Estado, empresas y academia para general un plan de manejo integrado de esta parasitosis (Rozas y Asencio, 2007), el cual establece entre otras características, un umbral de carga parasitaria. En enero del 2015, este umbral sufrió una nueva modificación estableciendo que tres hembras ovígeras es el límite que determina la clasificación del centro de cultivo, como también, la aplicación de tratamientos farmacológicos para reducir las cargas parasitarias (Sernapesca, 2015).

En general, uno de los principales objetivos de los programas de manejo integrado es reducir las potenciales interacciones entre hospederos y parásitos mediante una amplia gama de herramientas para el control de los parásitos (Brooks, 2009). Asimismo, debe considerar el desarrollo de conocimiento biológico y definición de umbrales de acción (Kogan, 1998). El propósito del establecimiento de umbrales, es delimitar niveles de plaga aceptables y proteger a la especie en cultivo (Ehi-Eromosele y col., 2013). Una vía de obtención de umbrales que permitan proteger a la especie en cultivo, es mediante el monitoreo del bienestar del animal. El bienestar animal se refiere al estado de un animal en relación con sus intentos para hacer frente a su ambiente (Broom, 1988). Para mantener su bienestar, el animal ejerce la denominada “respuesta de estrés”, la cual es parte de la estrategia adaptativa para enfrentar alteraciones en la homeostasis (Baldwin, 2011; Sutanto y De Kloet, 1994; Ellis y col., 2012). Wells y col. (2006) mencionaron que los peces sufren efectos sub-letales cuando son parasitados por Lepeoptheirus salmonis, los cuales pueden ser cambios a nivel fisiológico, bioquímico, e inmunológicos (Fast y col., 2006; Wagner y col., 2008; González y col., 2015b). El presente estudio tiene como propósito evaluar la respuesta de salmón Atlántico (Salmo salar) frente a una infestación con parásitos adultos de Caligus rogercresseyi a los 22 días posterior al desarrollo de una cohorte, infestación de más de 40 días, y de peces infestados que enfrentan una infestación abrupta del estadio infestante.

Metodología

Los experimentos fueron llevados a cabo en las instalaciones de la Universidad Austral de Chile, sede Puerto Montt. Individuos de Salmo salar (n=280) fueron ubicados al azar en 12 estanques circulares (300 L) y aclimatados por 30 días. El peso promedio inicial de los peces fue de 85,25 g (n=72, rango: 81,01 – 89,45 g, intervalo de confianza (IC) 95%). Las condiciones de mantención fueron: flujo abierto con agua de mar filtrada y esterilizada, un fotoperiodo de 8:16 h día: oscuridad (Marín y col., 2015). Los parámetros promedio fueron: salinidad de 31‰, temperatura de 11.3 °C y saturación de oxígeno de 86,8%. La alimentación diaria fue "ad libitum" utilizando pellets comerciales a una ración de 1,5% del peso corporal. Para la infestación artificial, los copepoditos fueron obtenidos desde el Laboratorio de Interacciones Ecológicas de la Universidad Austral de Chile. Desde hembras ovígeras, se extrajeron los sacos ovígeros para obtener los huevos maduros. Estos últimos, se incubaron en agua de mar filtrada y esterilizada (32‰) y en condiciones controladas de incubación. El proceso de infestación se realizó de acuerdo a Marín y col. (2015), con un tiempo de detención del flujo de agua de seis horas.

Para las tres condiciones de infestación, se utilizó un diseño que contempló dos grupos: infestados y control (sin infestación). Para el desarrollo de la infestación, hasta el estado adulto a los 22 días, se utilizaron dos presiones de infestación (PI), de 50 y 100 copepoditos por pez (cop/ pez), que permitieron la obtención de un gradiente de carga parasitaria; y un control (dos réplicas cada uno). Se muestreó un día pre-infestación, y a los 22 días post infestación (dpi), de modo de encontrar el estadio adulto (macho y hembra). Para la exposición del pez a infestaciones de más de 40 días, se utilizó solo una PI de 75 cop/ pez (tres réplicas cada grupo). Esta cohorte se dejó desarrollar durante 56 días, permitiendo el desarrollo desde el estadio copepodito al adulto, sin desarrollo de cohortes adicionales. Se realizaron muestreos a los 49 y 56 dpi. Para la infestación abrupta con copepoditos en peces infestados con adultos, se utilizó una PI de 75 I+D cop/pez. La cohorte fue mantenida por 56 días post primera infestación (dppi). A los 65 dppi, el grupo de peces infestados fue re-infestado con una PI de 240 cop/pez. Se realizaron muestreos a los 56 dppi y a los 67 dppi (dos días post segunda infestación (dpsi)).

Durante los muestreos, los peces fueron sometidos a una sobredosis de benzocaína clorhidrato (>250 mg L^-1) y a eutanización completa mediante separación de la médula espinal previo a la extracción de las muestras. La sangre fue colectada desde el pedúnculo caudal y depositada en tubos heparinizados. Posteriormente, se centrifugó para la obtención del plasma (5 min, 2.000 g, 4 °C) y almacenó a ?20 °C hasta análisis. Se inspeccionaron los peces, el agua y las bateas en búsqueda de parásitos, los cuales fueron contabilizados y clasificados de acuerdo a González y Carvajal (2003). Se registró el peso de los peces y se extrajeron muestras de piel desde el flanco izquierdo de cada pez, preservándolas en solución fijadora de Davidson AFA. En el plasma se midieron los parámetros cortisol, glucosa, triglicéridos, lactato, proteínas, aminoácidos mediante kits comerciales adaptados para microplacas de 96 pocillos (Vargas-Chacoff y col., 2009a, 2009b). La osmolalidad plasmática se midió en un osmómetro de presión de vapor. Se obtuvieron sub-muestras de piel (2x2 cm) desde la zona media-dorso-lateral del cuerpo del pez, las que fueron procesadas mediante técnicas histológicas de rutina. Se obtuvieron secciones de 5 µm en forma casi paralela a la estratificación de la epidermis (Pittman y col., 2013), las que fueron teñidas con hematoxilina – ácido periódico de Schiff (PAS). En un área determinada de las secciones (0,2x0,2 mm), se contabilizó el número de células mucosas (hiperplasia) y el diámetro de las cédulas (hipertrofia) (Fast y col., 2002), mediante un disector óptico (Russ y DeHoff, 2000).

Para el análisis estadístico de los datos, se comprobaron los supuestos de normalidad y homocedasticidad. Se realizaron análisis de comparación de grupos mediante un Anova anidado correspondiente a un modelo lineal generalizado (Quinn y Keough, 2002). Para la determinación de las relaciones entre las variables fisiológicas y las cargas parasitarias, se chequearon los supuestos de normalidad, independencia y el error constante de la varianza (Wells y col., 2006). Se realizaron regresiones lineales simples y en trozos. Este último permite la estimación de puntos de quiebre en las relaciones (umbrales parasitarios) (Wells y col., 2006). Las significancia de cada punto estimado se estimó de acuerdo a Shea y Vecchione (2002).

Resultados

Abundancias del parásito Caligus rogercresseyi Los estanques tuvieron una prevalencia del 100% durante los experimentos. Todos los parásitos alcanzaron el estadio adulto a los 22 días, siendo el 54% machos y 46% hembras (Tabla 1) y la abundancia promedio fue de 19,75 parásitos/pez. A los 49 dpi solo se observaron adultos, siendo 69,82% hembras y 30,53% machos. A los 56 dpi se observó que el 61,33% correspondía a hembras y el 38,67% a machos (Tabla 1). Las abundancias promedio fueron 8,53 y 5,1 parásitos/pez a los 49 y 56 dpi, respectivamente. A los 67 dppi/2 dpsi el 98,12% de los parásitos correspondió a copepodito, el 1,44% a hembras y 0,44% a machos. La abundancia promedio fue de 185,8 parásitos/pez (Tabla 1).

Respuesta fisiológica de Salmo salar a Caligus rogercresseyi

Previo a la infestación, no se observaron diferencias significativas entre estanques para las variables en estudio. A los 22 dpi, sólo la osmolalidad plasmática mostró una relación positiva con el aumento de las cargas parasitarias. Para las variables cortisol, glucosa, proteínas, aminoácidos, triglicéridos, lactato, número y diámetro de células mucosas de la piel se detectaron regresiones en trozo, por lo que se logró la estimación de puntos de quiebre significativos. Los valores de parásitos/ pez fueron 6,91 para el cortisol, 6,99 para la glucosa, 14,35 y 14,00 para el número y diámetro de células mucosas de la piel, respectivamente, 20,88 para las proteínas, 21,81 para los aminoácidos, 20,20 para los triglicéridos, y 20,92 para el lactato (Tabla 2). No se detectaron efectos significativos en el peso de los peces entre grupo de peces y entre días. Para la infestación de más de 40 días, se detectó que no hubo diferencias significativas entre los 49 y 56 dpi para ninguna de las variables en estudio, por lo que se agruparon los datos de ambos días. Se detectaron regresiones lineales significativas. El cortisol aumenta y el diámetro disminuye con el aumento de cargas parasitarias (Tabla 2). Se estimaron puntos de quiebre significativos con valores de 5,9 y 5,8 parásitos/pez para el lactato plasmático y el número de células mucosas de la piel, respectivamente (Tabla 2).

Para los peces infestados por adultos de C. rogercresseyi que enfrentan altas infestaciones de copepoditos, no se detectaron diferencias significativas en las variables de estudio para el grupo control, como tampoco, para las proteínas, aminoácidos, lactato y osmolalidad del grupo infestado entre los días 56 dppi y 67 dppi (2dpsi). Sin embargo, los peces infestados mostraron un aumento significativo para el cortisol desde 14,8 ug/dl a los 56 dppi a 30.8 ug/dl a los 67 dpfi (2 dpsi), siendo significativamente mayor que el grupo control. La glucosa y los triglicéridos disminuyeron significativamente desde los 56 dppi a los 67 dppi/2dpsi con valores desde 6,9 a 5,4 mmol/L para la glucosa, y desde 2,4 a 1,1 mmol/L para los triglicéridos, con valores significativamente más altos para el grupo control que el grupo infestado en el día 67 dpfi (2 dpsi). El número de células de la piel de peces infestados fue significativamente mayor que grupo control a los 56 dppi (88,7 y 75,2 células por área, respectivamente). Por otra parte, el diámetro de las células mucosas de peces infestados fue significativamente menor en ambos días, y disminuyó significativamente desde 15,2 ?m a los 56 dppi a 13,1 ?m a los 67 dppi (2 dpsi). Se detectaron regresiones lineales negativas a los 67 dppi (2 dpsi) para las variables triglicéridos y el diámetro de las células mucosas de la piel (Tabla 2). No se logró la estimación de puntos de quiebre significativos a los 67 dppi/2 dpsi.

Discusión

La fisiología del pez se ve alterada producto de la infestación de parásitos adultos de C. rogercresseyi. Los peces sufren modificaciones en las variables energéticas, junto con una alteración en el cortisol plasmático. Esto sugiere que el pez ejerce una respuesta de estrés para compensar la presencia del parásito adulto. Bowers y col. (2000) describieron que L. salmonis induce una respuesta de estrés en S. salar, siendo los estados avanzados de desarrollo los más perjudiciales para el pez, debido al movimiento activo de estos estadios, coincidiendo con el presente estudio. Por otra parte, fue posible detectar que el bienestar del salmón Atlántico (~ 80 gramos) se ve comprometido cuando la infestación alcanza niveles de seis a siete parásitos por pez, siendo el mínimo umbral estimado para el conjunto de variables (mayores detalles en González y col. (2015b)). Para L. salmonis, Wells y col. (2006) estimaron un umbral parasitario de 12–13 parásitos por pez, consistente entre la mayoría de las variables fisiológicas, siendo un valor más alto que los estimados en el presente estudio. Aparentemente, el salmón intenta restablecer su bienestar a través de una reorganización a nivel energético cuando C. rogercresseyi alcanza el estado adulto, a niveles que le permita enfrentar la parasitosis.

Cuando el pez enfrenta una infestación de parásitos adultos por más de 40 días, cargas superiores a cinco o seis parásitos por pez inducen una alteración en la fisiología del salmón Atlántico, observado en los resultados de lactato plasmático y en células mucosas de la piel. Como se mencionó previamente, González y col. (2015b) determinaron un umbral de seis a siete parásitos por pez por sobre el cual el bienestar del pez se ve alterado, coincidiendo con el umbral determinado en el pez infestado por más de 40 días, como también con los valores estimados en variables fisiológicas por Wells y col. (2006) bajo infestaciones de L. salmonis en Salmo trutta. Nuevamente, se observa que el parásito induce un incremento en la demanda energética, observado a través del aumento de los metabolitos energéticos.

Infestaciones abruptas del estadio infestante de C. rogercresseyi sobre peces previamente infestados con parásitos adultos, inducen una respuesta de estrés aguda en el pez. Ocurre un aumento del cortisol plasmático, una disminución de los metabolitos energéticos, además de un potencial aumento en la producción de mucus (debido al aumento de células mucosas pequeñas) (mayores detalles en González y col. (2015a)). Probablemente, esta última respuesta ocurre para rechazar al parásito, como describe Olafsdottir y Buchmann (2004) en su estudio. Durante el proceso de infestación, el copepodito se fija mediante el filamento frontal a las escamas y los rayos de las aletas (Bron y col., 1991). El pez posee un sistema nociceptivo periférico asociado con cambios en la actividad cerebral durante los estímulos nocivos (Sneddon, 2009). Es probable que el proceso de infestación es una condición estresante para el pez, provocándole dolor que puede ser inducido por la interrupción de la epidermis, debido a la fijación del filamento frontal (Johnson y Albright, 1992).

En resumen, el presente estudio contribuye con hallazgos relevantes para la caracterización de la respuesta fisiológica del hospedero S. salar al ectoparásito Caligus rogercresseyi. Esta información sugiere que las cargas parasitarias deberían mantenerse bajas (menos de seis parásitos por pez), de modo de no inducir efectos perjudiciales en el bienestar del pez. Estos hallazgos son de utilidad para el desarrollo de las estrategias de manejo y control de C. rogercresseyi en el contexto de un programa de manejo integrado, el cual requiere de la estimación de umbrales parasitarios, con base en la información biológica-científica de la interacción entre hospedero y parásito. A su vez, esta información puede apoyar la toma de decisiones, como también, para futuras mejoras en las estrategias de manejo para la industria del salmón, considerando salvaguardar el bienestar del pez.

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