Genotipificación y factores de virulencia de aislados de Flavobacterium psychrophilum obtenidos a partir de salmónidos en Chile

Pedro Ilardi Lazcano1,*, Marcial Vargas del Campo1, Juan Battaglia1, Carlos Sandoval2 y Harold Oliva1 1Veterquímica S.A. Laboratorio de investigación y desarrollo, Santiago, Chile.* (pilardi@veterquimica.cl) 2BiovacS.A. Laboratorio de investigación y desarrollo, Puerto Montt, Chile

Introducción Flavobacterium psychrophilum es el agente etiológico de síndrome del alevín de trucha arcoíris y de la enfermedad bacteriana del agua fría (RTFS y BCWD, por sus siglas en inglés), las cuales son las infecciones sistémicas más importantes en salmónidos cultivados en agua dulce, y que afectana todas las especies de salmónidos (Avendaño–Herrera et al., 2009). Originalmente, la distribución geográfica de F. psychrophilum estaba delimitada a Norte América, hoy en día, el agente ha sido reconocido como un patógeno de ocurrencia mundial en los cultivos de agua dulce, ya que ha sido aislado en Europa, Chile, Perú, Tasmania, Australia, Japón y Corea del Sur (Nematollahi et al., 2003; Valdebenito y Avendaño–Herrera, 2009; Orieux et al., 2011). En Chile, desde el primer reporte de la enfermedad en trucha arcoíris, en 1993 (Bustos et al., 1995) este patógeno se ha distribuido rápidamente en otras especies de salmónidos, como salmón Atlántico y salmón coho. La intensificación del cultivo del salmón en Chileha dado lugar acrecientes problemas delas enfermedades bacterianasy las infeccionesporF. psychrophilumson considerados comouno de losprincipales problemas de laacuicultura de agua dulceenChile, donde las infeccionespueden dar lugar auna tasa de mortalidaddel 5% al70% enalevines( Avendaño–Herrera et al., 2009 y Valdebenito yAvendaño-Herrera, 2009). La evidencia epidemiológica indica que las cepas de F. psychrophilum son bioquímicamente homogéneas, con la excepción de la presencia o ausencia de algunas actividades enzimáticas, como lo son la hidrólisis de caseína, gelatina y elastina (Soule et al., 2005). Además, no todas las cepas de F. psychrophilum son capaces de causar el mismo grado de mortalidad y pueden ser antigénicamente diversas (Crump et al. 2001;Madetoja et al., 2002;LaFrentz et al., 2003; Valdebenito & Avendaño–Herrera, 2009). La variación genética entre los aislados ha sido ampliamente estudiada usando varias técnicas de tipificación como ribotipo, perfiles de plasmidios, RAPD–PCR y RFLP– PCR (Chakroun et al., 1997;Chakroun et al., 1998;Madsen&Dalsgaard, 2000;Madetoja et al., 2001, 2002;Izumi et al., 2003).

Los estudios de aislados obtenidos a partir de brotes de la enfermedad en cultivos de trucha en Dinamarca, sugieren que existe un tipo de ribotipo dominante (Madsen&- Dalsgaard 2000;Madetoja et al., 2002). Sin embargo, otros estudios muestran una gran diversidad genética entre diferentes lugares geográficos Chakroun et al., 1997, 1998;Madetoja et al., 2000; Apablaza et al. 2013. Soule et al., (2005); Izumi et al., (2003) y Chakroun et al. (1998) han publi- cado evidencia de que existe una relación entre las diferentes cepas de F. psychrophi- lum y su hospedero. En estudios recientes, utilizando hibridación genómica con mi- croarreglos de ADN, se demostró que 34 aislados de F. psychrophilum,geográficamente diversos, pudieron ser clasificados en dos linajes genéticos distintos correlacionando su origen a partir de trucha o salmón. El fragmento del gen del 16SrRNA, es el más utilizado para técnicas de tipificación bacterianas, debido a su alto grado de conservación.. Es por esto que las variaciones de este gen suelen determinar dis- tintos comportamientos epidemiológicos. Es en base a esto que en F.psychrophilum se utiliza la variabilidad de este gen en la identificación de cepas y para discriminar entre virulentas y no virulentas. (Izumi et al., 2000; Ramsrud et al., 2007). Con la capacidad de distinguir la presencia de uno o ambos alelos del gen del 16s rRNA, provee valiosa información para entender como estos polimorfismos están distribui- dos geográficamente entre las diferentes especies de salmónidos. Otra técnica de genotipificación de ais- lados de F.psychrophilum, se realiza a través de RFLP–PCR del gen de la girasa sub unidad B (gyrB), con la cual se pueden cla- sificar los aislados del patógeno en cuatro genotipos, relacionado estos con su origen y resistencia a antibióticos (Izumi et., al2003y 2007). En el presente estudio se pretende estu- diar la variabilidad genéticade 87 aislados nacionales del patógeno de peces F.psychrophilummediante los polimorfismos del gen del 16S rRNA, genotipificación mediante RFLP–PCR del gyrB y mediante la determinación de factores de virulencia.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

Un total de 87 aislados de F. psychrophilum provenientes de brotesocurridos desde el año 2006 al 2012, desde la Región Metropolitana hasta la Región de Los Lagos en Chile, fueron examinados en este estudio. La colección está compuesta por 37, 44 y 1 cepa aisladas a partir de salmón Atlántico (Salmo salar), trucha arcoíris (Oncorhynchus. mykiss) y salmón coho (O. kisutch), respectivamente, y 5 aislados sin identificar. Además, se incluyeron en este estudio con fines comparativos la cepa de referen- cia de F. psychrophilum ATCC 49418T y la cepa B97026 (Valdebenito & Avendaño– Herrera, 2009) aislada a partir de trucha arcoíris en el Reino Unido, entregada por la Dra. Kim Thompson (Institute of Aqua- cultureUniversity of Stirling, Escocia). La identidad de todos los aislados utilizados se comprobó mediante procedimientos fe- notípicos estándar (Bernardet et al., 2002) ymediante PCR especie–especifico (Urdaci et al., 1998). Para todos los experimentos, las cepas fueron crecidas en placas con agar TYES e incubadas a 15°C por 3–5 días. Los stocks bacterianos fueron almacenados en viales de criopreservación (AES Labora- tory).a –80°C.  Hidrólisis de gelatina y elastina La hidrólisis de los sustratos gelatina y elastina son considerados factores de viru- lencia entre los aislados de F. psychrophilum, ya que éstos son componentes de la piel y músculo de los peces. De esta manera, la capacidad de degradarlos por parte de las bacterias hace que sean más o menos virulentos durante un cuadro de RTFS. La hidrólisis de los sustratos fue llevada a cabo de acuerdo al protocolo de Soule et al., (2005).

Extracción de ADN

El ADN de los aislados se obtuvo a partir de cultivos frescos, utilizando el kit comercial InstaGeneMatrix (Bio–Rad). El ADN ex- traído fue mantenido a –20°C hasta su uso en las reacciones de PCR. PCR y electroforesis Todas la amplificaciones fueron realizadas utilizando el kit comercial Ready–To–Go™ PCR beads (GE Healthcare). En todas las rondas de PCR se incluyó como control negativo, la misma reacción de PCR pero con agua destilada estéril en vez de ADN. Todas las amplificaciones se llevaron a cabo utilizando un termociclador TC–512 Thermalcycler (Techne) y los productos de amplificación fueron separados mediante electroforesis horizontal en geles de aga- rosa al 1,5% (p/v), separados por 90min a 101V, visualizados con bromuro de Eti- dio (Bio–Rad) y fotografiados bajo luz UV. Como estándar de peso molecular se utilizó un marcador de 100pb. Determinación de los alelos del gen 16S rRNA por PCR Para distinguir entre la presencia de uno o los dos alelos del gen del 16S rRNA, se realizó el protocolo propuesto por Ramsrud et al., (2007), utilizando los partidores específicos para la determinación del alelo CFS 259–93 (virulento) y del alelo ATCC 49418T(avirulento) de 600 y 298pb respectivamente (figuras 1 y 2). PCR–RFLP Para el análisis de los RFLP, dos juegos de partidores fueron usados de acuerdo al protocolo de Izumi et al., (2000 y 2003), el primer par de partidores universales GYR–1 y GYR–1R, que generan un fragmento de 1178pb del gyrB y otro fragmento de 300pb.El otro par de partidores, PSY–G1F y PSY–G1R son específicos para F. psychrophilum y se obtiene un producto de amplificación de 1017pb. Después del análisis de todos los productos por electroforesis, se procedió a realizar la digestión de los productos con las enzimas de restricción HinfIsobre los productos de amplificación obtenidos con los partidores universales (genotipo A o B) y RsaIsobre los producto obtenido de los partidores específicos (genotipo R o S) siguiendo las recomendaciones del fabricante, para luego ser analizados mediante electroforesis horizontal (figura 3 y 4).

RESULTADOS Todos los aislados utilizados en este estudio, los cuales fueron identificados mediante procedimientos fenotípicos estándar y PCR especie–especifico, corresponden al patógeno de peces Flavobacterium psychrophilum. La cepa de referencia fue capaz de degradar gelatina y elastina y posee ambos alelos del gen del 16S rRNA (ATCC 49418T y CFS 259–93) mientras que la cepa B97026 sólo resultó positiva para la degradación de la gelatina y también posee los dos alelos. En el caso de los 87 aislados chilenos, independientemente del huésped de aislamiento, 35 son capaces de degradar ambos sustratos y todos estos aislados tienen sólo elalelo CFS 259–93. Otros 20 aislados fueron capaces de degradar sólo elastina y también tienen sólo el alelo virulento. 14 aislados sólo fueron capaces de hidrolizar gelatina y de éstos sólo 6 presentaban el alelo virulento mientras que los 8 restantes presentaron ambos alelos. Finalmente, 13 aislados no fueron capaces de degradar los sustratos y 12 presentaron ambos alelos. Al analizarlos por especie, tenemos que el 59,45% de los aislados provenientes de salmón Atlántico presentan el alelo virulento mientras que el 40,54% presentaron ambos alelos. En el caso de las truchas, encontramos que el 81,81% de los aislados presentaron el alelo virulento mientras que sólo el 18,19% presentan ambos alelos. El aislado obtenido a partir de salmón coho sólo presentó el alelo virulento, al igual que los 5 aislados sin identificar. En el caso de los resultados de los RFLP–PCR,se observó que el 55,17% de los aislados independiente del huésped de aislamiento, correspondieron al genotipo B/R, mientras que el restante 44,83% al genotipo B/S.Además,al relacionar el genotipo con el alelo del gen del 16s rRNAse obtuvo que 36,78% de los aislados posee el genotipo B/S o B/R con el gen CFS 259–93 y el 39,08% de éstos fue capaz de degradar elastina y gelatina, y sólo uno no degradó ambos sustratos. Un 18,39% presentó el genotipo B/S y ambos genes. Sólo el 8,05% son genotipo B/R y ambos alelos, además los aislados B/S y B/R que presentaron ambos alelos, ninguno de ellos fue capaz de degradar elastina. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES Si bien los aislados deF. psychrophilum constituyen un grupo bioquímicamente homogéneo, son las hidrólisis de ciertos sustratos, en este caso, la gelatina y elastina (componentes de la membrana basal y del tejido conectivo en peces), los que generan diferencias bioquímicas entre los aislados y están en estrecha relación con la virulencia de la cepa (Soule et al., 2005). De esta manera, los aislados que son capaces de degradar ambos sustratos, y en especial elastina, se consideran más virulentos que aquellos capaces de degradar uno o ninguno. Por otra parte, el genotipo del gen del 16S rRNAde las cepas de F. psychrophilum, está relacionado con la virulencia de éstas, y así, los aislados que presenten el alelo CSF 259– 93, son potencialmente más virulentos que los que presentan ambos alelos o sólo el alelo ATCC 49418T(en el presente estudio no se encontraron aislados que sólo presentaran este alelo) (LaFrentz et al., 2003; Soule et al., 2005; Ramsrud et al., 2007; Valdebenito y Avendaño–Herrera 2009). Además,existe una estrecha relación entre la degradación de la elastina y el genotipo, de esta manera son más virulentos los aislados que presentan la combinación elas- tinasa positiva y CSF 259–93 (Soule et al., 2005 y Valdebenito y Avendaño–Herrera 2009). En el presente estudiose observó que la mayoría de los aislados obtenidos presentan esta combinación y, en espe- cial, en los aislados provenientes de trucha arcoíris donde más del 50% presenta esta combinación (figura 5).

En el caso de la relación huésped genotipo A o B, es posible mediante el RFLP–PCR, discriminar a nivel de especie de origen, diferenciando entre aislados provenientes de salmónidos (genotipo B, en nuestro caso) y aislados provenientes Ayu (Plecoglossusaltivelis, genotipo A), de acuerdo a lo establecido por Izumi et al., (2003). En cuanto a los genotipos S y R específicos para F. psychrophilum,éstos se encuentran asociados al origen geográfico de los aislados, principalmente a EE.UU. y Europa (Izumi et al 2003 y 2007), por lo que no se pudo asociar éstos con alguna especie en particular, en este caso, salmón Atlántico, trucha arcoíris o salmóncoho, por lo que se necesitan otros estudios para determinar su origen. En el presente estudio se determinaron diversos factores de virulencia presentes en los aislados de F. psychrophilum como lo son la hidrólisis de elastina y gelatina y los alelos del gen del 16S rRNA, y cómo éstos se distribuyen entre las diferentes especies de salmónidos cultivadas en Chile. Además, se pudieron identificar los diferentes genotipos descritos del gyrBpara aislados de F. psychrophilum obtenidos desde salmónidos cultivados en nuestro país. Finalmente, podemos concluir que este tipo de estudioes sumamente valioso para el desarrollo de vacunas contra el agente, ya que ayuda a discriminar entre cepas avirulentas y virulentas del patógeno de peces Flavobacterium psychrophilum y entrega información valiosa sobre la epidemiología del agente en nuestro país. 

REFERENCIAS

Apablaza, P., Løland A. D., Brevik1 Ø. J., Ilardi , P., Battaglia J. and Nylund A. 2013. Genetic va- riation among Flavobacterium psychrophilum isolates from wild and farmed salmonids in Norway andChile. Journal of Applied Microbiology.114(4): 934–946. Avendaño–Herrera R., Ilardi P., Fernández, J. 2009.Significance of Flavobacterium diseases on sal- monids farming in Chile.2nd Conference on Members of the Genus Flavobacterium. MGEN, Paris, France September 21–23, 2009. 10 pp. Bernardet J–F., Nakagawa Y. & Holmes, B. 2002. Proposed minimal standards for describing new taxa of the family Flavobacteriaceaeand emen- ded description of the family. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.52: 1049–1070. Bustos P.A., Calbuyahue J., Montaña J., Opazo B., Entrala P. &Solervisenc R. 1995. First isolation of Flexibacterpsychrophilus, as causative agent of ra- inbow trout frysyndrome (RTFS), producing rainbow trout mortality in Chile”.Bulletin of theEuropean Association of Fish Pathologists. 5(15): 162–164. Chakroun C., Urdaci, M.C., Faure D., Grimont F. &Bernarder J–F.1997. Random Amplified Poly- morphic DNA analysis provides rapid differentiation among isolates of the fish pathogen Flavobacteriumpsy- chrophilumand among Flavobacterium species. Disea- ses of aquatic organisms. 31: 187–196. Crump E.M., Perry M.B., Clouthier S.C. & Kay W.W. 2001. Antigenic characterization of the fish pathogen Flavobacterium psychrophilum.Applied and Enviromental Microbiology.67(2): 750–759. Izumi S., Aranishi F. and Wakabayashi H. 2003. Genotyping of Flavobacterium psychrophilumusing PCR–RFLP analysis.Diseases of Aquatic Organisms. 56: 207–214. Izumi S., Ouchi S., Kuge T., Arai H., Mito T., Fujii H., Aranishi F. & Shimizu A. 2007.PCR– RFLP genotypes associated with quinolone resistance in isolates ofFlavobacterium psychrophilum”. Journal of Fish Diseases. 30: 141–147. LaFrentz  B.R.,  LaPatra  S.E.,  Jones  G.R. &CainK.D..2003.Passive immunization of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), against Flavobacterium psychrophilum, the causative agent of bacterial coldwater disease and rainbow trout fry syndrome. Journal of Fish Diseases 26: 377–384. Orieux N., Bourdineaud J–P., Douet D–J., Daniel P., Le Hénaff, M. 2011. Quantification of Flavobac- terium psychrophilum in rainbow trout, Oncorhyn- chusmykiss(Walbaum), tissues by qPCR”.Journal of Fish Diseases. 2011, N°34, p 811–821.Ramsrud, A.L., LaFrentz, S.A., LaFrentz, B.R., Cain, K.D. & Call, D.R. 2007. Differentiating 16s rRNA alleles of Flavobacterium psychrophilum using a simple PCR assay. Journal of Fish Diseases.30:175–180. Soule M., LaFrentz S., Cain K., LaPatra S. & Call D. 2005 b. Polymorphisms in 16S rRNA genes of Flavobacterium psychrophilum with elastin and tetra- cycline resistance. Diseases of AquaticOrganisms. 65: 209–216. Urdaci M. C., Chakraun C., Fanre D. y Bernardet J–F. 1998. Development of a PCR reaction assay for identification and detection of the fish pathogen Fla- vobacterium psychrophilum.Research in Microbiology. 149: 519–530. Valdebenito S.and Avendaño–Herrera, R. 2009. Phenotypic, serological and genetic characterization of Flavobacterium psychrophilum strains isolates from salmonids in Chile. Journal of FishDiseases. 32:321–333.