Virus IPN: La importancia de la caracterización molecular y el contexto epidemiológico de aislados chilenos

Dr. Juan Kuznar H; Laboratorio de Virología. Laboratorio Nacional de Referencia. Cigren. Instituto de

Química y Bioquímica, Facultad de Ciencias – Universidad de Valparaíso.

Introducción

El virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa, (virus IPN), es uno de los patógenos más importantes en términos del daño que produce a la acuicultura chilena. Está presente en Chile desde hace al menos tres décadas, momento en el cual se detectó por primera vez (1,2). Los análisis iniciales mostraron que el virus procedía desde Norteamérica, presumiblemente como contaminante de ovas.

Desde allí en adelante, y conjuntamente con el explosivo desarrollo de la industria salmonicultora chilena, el virus IPN, al igual como ocurre con todos los virus en diferentes sistemas hospedador-patógeno, ha sido sometido a diferentes tipos de presión selectiva que han conducido a su diversificación genética. Paralelamente, informes oficiales muestran que hay una amplia distribución de la enfermedad producida por el virus y con una alta incidencia en el diagnóstico, afectando principalmente al salmón Atlántico (3). De hecho, información reciente muestra que el virus IPN es uno de los patógenos más detectados por los laboratorios de diagnóstico, tanto en instalaciones en agua dulce como en el mar.

Además de la amplia distribución del virus entre los diferentes centros de cultivo, contribuye a la dificultad de controlarlo el hecho que el virus IPN origina infecciones persistentes, esto es, que peces sobrevivientes a un brote, se convierten en portadores de por vida constituyendo reservorios. En general, ocurre entonces, que la industria del salmón convive con una situación endémica en la que se debe asumir una cierta magnitud más o menos constante de pérdidas que afecta a la industria año tras año.

En tanto, el problema con esto es que toda esta aparente estabilidad de pérdidas constantes puede desestabilizarse debido a la aparición de variantes genéticas con ventajas nuevas frente a otros genotipos prevalentes, que pueden, por ejemplo, ser más virulentos, multiplicarse en especies distintas, ser más resistentes a la inactivación o bien ser más exitosos en infectar o multiplicarse productivamente en el hospedador en otros estados de su desarrollo. Asimismo, sobrevivientes a la enfermedad en agua dulce podrían generar mortalidades desastrosas al pasar a agua de mar.

Por las razones antes expuestas, se hace necesaria una continua vigilancia sobre los diferentes genotipos y genogrupos de virus IPN y sus características más relevantes. Con este conocimiento se puede tomar medidas de control frente a la aparición de un brote de la enfermedad generado por una variante que se puede caracterizar y contener con medidas preventivas.

Respecto de la continua vigilancia a que debe estar sometido el virus IPN, además del surgimiento de genotipos con ventajas selectivas nuevas, existe una consideración adicional de carácter práctico, y es que pueden surgir variantes genéticas del virus que no son reconocidas por algunas técnicas de diagnóstico. Por ejemplo, mutaciones en sitios de reconocimiento para partidores de PCR. En esta condición, si no se usa la técnica adecuada, un brote de la enfermedad puede ser atribuido a una condición desconocida o diferente de la real.

Chile se ha convertido en el segundo productor mundial de salmónidos, la situación exige que seamos especialmente previsores en anticipar posibles cambios en la condición basal de pérdidas por un determinado agente infeccioso. Hasta el momento, los virus IPN aislados en Chile han sido identificados como pertenecientes a los genogrupos 5 y 1 (4,5 y 6). Sin embargo, las zonas geográficas examinadas cubren una extensión muy minoritaria y las muestras analizadas provienen, principalmente, desde brotes en centros de agua dulce.

Es en base a estos antecedentes que estos últimos años hemos desarrollado un estudio sistemático para elaborar un perfil sobre la situación del virus IPN. Al respecto, me centraré, especialmente, en dos proyectos secuenciales, con algunos resultados y proyecciones, que estamos desarrollando con los aportes técnicos y financieros de Sernapesca y la Subsecretaría de Pesca y Acuicultura.

El primero de ellos, “Identificación de cepas y nuevas variantes de virus IPN, evaluación del impacto de éstas en atención a su distribución geográfica y caracterización de cuadros clínicos” (2013-2014), dirigido por el autor de este artículo; y el segundo, “Determinación de factores epidemiológicos de riesgo en la presentación clínica de la enfermedad Necrosis Pancreática infecciosa” (2015- 2016), dirigido por la Dra. Yoanna Eissler y con la colaboración especial de la Dra. Carla Rosenfeld epidemióloga de la Universidad Austral de Chile en Valdivia.

Resultados más relevantes

El primer imperativo fue constatar si los procedimientos de detección mayoritariamente usados en la detección del virus IPN, permiten, efectivamente, una cobertura lo más amplia posible. Precisamente, como muestra, y a modo de ilustración con un extracto de nuestros resultados, tenemos que, de un total de 46 muestras, todas fueron positivas para las técnicas de PCR. Como era de esperar, asimismo, técnicas cuyo fundamento se basa en la detección de virus activo, dieron positivo para aquellas muestras provenientes de especímenes con una alta carga viral, por ejemplo, casos agudos en vez de portadores. La Tabla 1 muestra una fracción de las muestras analizadas.

Lo esencial es que se aumentó la cobertura geográfica del muestreo y, además, se demostró que las técnicas de PCR que comparamos y que se usan en Chile, por el momento, dan garantías de que se detecta al virus. En la Figura 1, se visualizan las zonas cubiertas.

Ésta es la primera vez que se muestra una cobertura tan amplia en el muestreo y análisis de muestras para el virus IPN, desde luego, aún insuficiente.

Para identificar a cuál de estos grupos pertenecía la muestra de la respectiva localización geográfica, se secuenció del segmento A, un sector de Vp2 de 1180 pb, comprendido entre las bases 151:1330 (7). Así se obtuvo el cladograma de la Figura 2. En él se observa como los virus IPN chilenos se han reagrupado en subgrupos o subtipos dentro de los genogrupos 1 (origen americano) y 5 (origen europeo), respondiendo al comportamiento de virus ARN, los cuales evolucionan y forman cuasi-especies (8). Este comportamiento se ha reportado en otras partes del mundo, como España, Irlanda, y Japón (9,10 y 11) donde ha ocurrido algo similar a Chile, introduciéndose el virus desde diferentes países por medio de importación de ovas o alevines.

Los resultados mostrados son parte de una publicación que está en prensa (13). Destacan en este trabajo las contribuciones del MCs. Juan Carlos Espinoza, y de los biólogos marinos, David Tapia y Pamela Torres.

El análisis de secuencias de los diferentes aislados no solamente sirve para genotipificarlos, relacionar estructura con función, o servir de fundamento para análisis epidemiológicos. Existe, además, una utilidad muy práctica, esto es, determinar si parte de la variabilidad genética ocurre en zonas de reconocimiento de partidores de PCR. Si esto ocurre, puede perderse la capacidad de reconocimiento y, por ende, un determinado protocolo de diagnóstico puede ser inútil ante nuevas mutaciones del virus en esos sectores.

Para visualizar la importancia de este tipo de variabilidad, es que hemos comparado las secuencias de numerosos aislados de virus IPN, precisamente en las zonas a las que deben unirse partidores de reconocimiento. Hemos analizado ocho parejas de partidores y sus respectivas secuencias blanco.

A manera de ilustración, se muestra el análisis de una de tales parejas y las mutaciones encontradas en algunos aislados chilenos. Se efectuó un análisis in silico (12), consistente en determinar la temperatura de apareamiento (tm), para cada pareja en función de las mutaciones encontradas. Así, por ejemplo, como se aprecia en la Tabla 2, si se acumulan cinco mutaciones, la tm es de 25 °C (Secuencia partidor R), por lo cual, no hay posibilidad de reconocimiento. Afortunadamente, estos partidores no se usan en Chile. Este trabajo fue liderado por el BQ Esteban Jorquera, con la colaboración del Dr. Pablo Conejeros y el autor de este artículo. El trabajo está en la fase final de publicación. En la Tabla 2 sólo se muestra una fracción de las cepas comparadas, esto para fines ilustrativos.

Actividades actuales y proyecciones

Lo mostrado en este breve artículo tiene por objeto mostrar una visión panorámica de las actividades de nuestro grupo de trabajo. Esto con algunos ejemplos seleccionados de resultados que son relevantes para un conocimiento integral de la situación del virus IPN en Chile.

Nuestra idea y, desde luego de la visión orientadora de Instituciones como Sernapesca y Subpesca, es la de construir un cepario nacional de virus IPN que permita conocer cuáles variantes y con qué características, se encuentran en las diferentes zonas geográficas de nuestro país. Pretendemos vincular determinantes moleculares con características epidemiológicas de riesgo y protección para la presentación de la enfermedad Necrosis Pancreática Infecciosa.

En este acoplamiento entre lo molecular y lo clínico consideramos los siguientes temas:

• Aislamiento, caracterización genética y mantención de cepas chilenas.
• Secuenciación completa de variantes seleccionadas, para evaluar la eventual presencia de recombinantes o reordenantes.
• Análisis bioinformático de secuencias para evaluar la vulnerabilidad de técnicas de PCR.
• Determinación de factores de riesgo y protectivos en la presentación clínica de la enfermedad.

Agradecimientos

A Alicia Gallardo, Marcela Lara y Mónica Rojas, (Sernapesca) y Alejandro Barrientos (Subpesca) por sus contribuciones técnicas y de financiamiento. Al contingente de esforzados tesistas de bioquímica, biología marina y tecnología médica.

Referencias

(1) McAllister PE, Reyes X (1984) Infectious pancreatic necrosis virus: isolation from rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, imported into Chile. J Fish Dis 7:4

(2) Espinoza E, Farias G, Soler M, Juan K (1985) Identity between infectious pancreatic necrosis virus VR-299 and a Chilean isolate. Intervirology 24:3

(3) Sernapesca (2013) Informe sanitario de salmonicultura en centros marinos año 2012. Servicio Nacional de Pesca y Acuicultura, https://www. sernapesca.cl/

(4) Calleja F, Godoy MG, Cárcamo JG, Bandín I, Yáñez AJ, Dopazo CP, Kibenge FS, Avendaño-Herrera R (2012) Use of reverse transcription-real time polymerase chain reaction (real time RT-PCR) assays with universal probe library (UPL) probes for the detection and genotyping of infectious pancreatic necrosis virus strains isolated in Chile. J Virol Methods 183:80-85

(5) Eissler Y, Pavlov MS, Conejeros P, Espinoza JC, Kuznar J (2011) Detection and quantification of Chilean strains of infectious pancreatic necrosis virus by real-time RT-PCR assays using Segment B as a target. Lat Am J Aquat Res 39:9

(6) Mutoloki S, Evensen O (2011) Sequence similarities of the capsid gene of Chilean and European isolates of infectious pancreatic necrosis virus point towards a common origin. J Gen Virol 92:1721-1726

(7) Blake SL, Schill WB, McAllister PE, Lee MK, Singer JT, Nicholson BL (1995) Detection and identification of aquatic birnaviruses by PCR assay. J Clin Microbiol 33:835-839

(8) Domingo E, Sheldon J, Perales C (2012) Viral quasispecies evolution. Microbiol Mol Biol Rev 76:159- 216

(9) Cutrin JM, Barja JL, Nicholson BL, Bandin I, Blake S, Dopazo CP (2004) Restriction fragment length polymorphisms and sequence analysis: an approach for genotyping infectious pancreatic necrosis virus reference strains and other aquabirnaviruses isolated from northwestern Spain. Appl Environ Microbiol 70:1059-1067

(10) Ruane NM, McCarthy LJ, Swords D, Henshilwood K (2009) Molecular differentiation of infectious pancreatic necrosis virus isolates from farmed and wild salmonids in Ireland. J Fish Dis 32:979-987

(11) Nishizawa T, Kinoshita S, Yoshimizu M (2005) An approach for genogrouping of Japanese isolates of aquabirnaviruses in a new genogroup, VII, based on the VP2/NS junction region. J Gen Virol 86:1973-1978

(12) SantaLucia J. Jr., Hicks D. (2004) The thermodynamics of DNA structural motifs. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 33:415-40

(13) Tapia D, Eissler Y, Torres P, Jorquera E , Espinoza J, Kuznar J (2015) A comprehensive study of IPNv in Chile: geographic distribution, phylogeny and detection of prevailing strains.