La enfermedad bacteriana del riñón (BKD) en el cultivo de salmónidos en Chile

Publicado Actualizado
Pedro Ilardi*, Fabián González; Katherine Fuentes; Isabel del Río; Jessica Abad; Carlos Sandoval; Harold

Oliva y Samuel Valdebenito. Laboratorio de Investigación y Desarrollo, Veterquímica S.A.

*holiva@veterquimica.cl

Renibacterium salmoninarum es una bacteria Gram positiva, catalasa y oxidasa positiva, generalmente en forma de diplobacilos pequeños (0,3–0,1 x 1,0–1,5 ?m) de fastidioso crecimiento (Figura 1) y es el agente causal de la enfermedad bacteriana del riñón (BKD, por su sigla en inglés), la cual es una patología que causa mortalidad en salmónidos de cultivo y en estado natural, durante las etapas de agua dulce y engorda en mar en Europa, Norte América, Japón y Chile. La enfermedad fue descrita por primera vez en 1933 en Escocia (Smith, 1964), pero no fue hasta que a principios de los 50 la bacteria fue aislada y crecida en laboratorio (Benediktsdottir y col., 1991). El largo tiempo de incubación suele variar entre 18 a 21 días a 6 o 9 semanas 12–15°C, en medio solido KDM–2 o KDM–C (Evelyn 1977; Austin y col., 1985; Daly y Stevenson 1985) y es uno de los principales problemas del método de cultivo cuando se trabaja con R. salmoninarum y es un serio inconveniente para los programas de control de la salud (Benediktsdottir y col., 1991). Esta patología se caracteriza por ser una infección sistémica (R. salmoninarum sobrevive dentro de los macrófagos del riñón), y generar un daño crónico del riñón, ya que el tejido producto de la infección es reemplazado por fibroblastos, los cuales carecen de la función fisiológica del órgano, lo cual debilita el sistema inmune del pez, afectando el proceso de esmoltificación, incluso se han reportado presentaciones asintomáticas o subclínicas en algunos casos (Austin y col., 1985; Banner y col., 1986; Mesa y col., 1999, Starliper y Teska 1995; Grayson y col., 2002; Arnason, 2010).

Externamente no presenta síntomas bien definidos al inicio de la enfermedad pero se puede encontrar entre ellos branquias pálidas, hemorragia en áreas cercanas a las aletas, decoloración de la piel y abdomen distendido en etapas avanzadas de la enfermedad (Fryer y Sanders, 1981; Bruno, 1986; Hirvelä– Koski, 2005), en casos muy agudos los cuadros externos se manifiestan con exolftamia severa bilateral, hemorragia sub opercular, abultamientos y úlceras. También se han reportado presentaciones cutáneas de la enfermedad en salmón coho en la fase de agua dulce (Carlos Sandoval, comunicación personal). Como síntomas internos se observan lesiones macroscópicas en órganos junto con la formación de nodulaciones blanquecinas principalmente en riñón, y en estado avanzado de la enfermedad, también en hígado, corazón y bazo. Otros signos clínicos internos incluyen esplenomegalia, hígado pálido, aumento de exudados peritoneales, anemia general y la formación de una membrana opaca alrededor de algunos de los órganos internos además de una acumulación de fluidos ascíticos en la zona abdominal. El riñón aumenta su tamaño (renomegalia) y adquiere un color gris–blanquecino y en casos severos necrótico (Fig 2, 3 y 4). La muerte es presumiblemente dada por el vasto daño de los órganos internos. (Fryer y Sanders, 1981; Bruno, 1986; Dale, 1994; Hirvelä–Koski, 2005).

En peces infectados con R. salmoninarum, tanto de forma natural como experimental se han detectado altas concentraciones de una proteína de 57 kDa en el suero y tejidos infectados. Esta proteína p57 corresponde al antígeno protéico predominante sobre la superficie de esta bacteria, y es el mayor constituyente de las proteínas extracelulares aisladas desde el sobrenadante de los cultivos (Getchell y col., 1985). Aunque la función exacta de la proteína p57 no ha sido determinada, se sabe que es un importante factor de virulencia de R. salmoninarum. Muchas de las propiedades inmunosupresivas de la bacteria son atribuidas a la proteína p57, incluyendo leucoaglutinación y reducción de la respuesta mediada por anticuerpos. La exposición de macrófagos a p57 puede reducir su capacidad bactericida y actividad de estallido respiratorio (Griffiths y Lynch 1991; Weins y Owen 2005). R. salmoninarum tiene además la capacidad de infectar y multiplicarse dentro de células fagocíticas en el organismo hospedero (Bruno, 1986; Gutenberger y col., 1997), de esta manera logran activar el mecanismo de estallido oxidativo inmediatamente después de la infección a macrófagos in vitro (Campos–Pérez y col., 1997), produciendo un rápido agotamiento de éste (Hardie y col., 1996), el hecho de que R. salmoninarum inactivadas por calor y opsonizadas estimulen una mayor producción detectable de O2– que bacterias vivas o muertas por tratamiento con luz UV, sugiere que la producción de O2– por los macrófagos está siendo aplacado por la actividad enzimática de superóxido dismutasa (SOD) y catalasa producidas por la bacteria. Posterior a éste agotamiento la bacteria es fagocitada y logra entrar al macrófago donde se multiplica en el citoplasma. (Gutenberger y col., 1997).

En estudios realizados en peces en estado natural, sanos e infectados con R. salmoninarum, tanto de forma natural como experimental (Nance y col., 2010) se han establecido cuatro etapas de la enfermedad, en base a los muestreos y los resultados obtenidos utilizando dos de las técnicas más utilizadas para la detección del patógeno, ELISA y qPCR con la misma muestra. La primera etapa es el doble negativo, que se traduce en un pez sano o con una infección sub–clínica (nula o baja carga de ADN y antígenos). La segunda etapa es la de expansión o multiplicación (qPCR positivo y ELISA negativo) durante esta etapa las bacterias están proliferando y rápidamente sintetizan ADN, con bajos niveles de síntesis de proteínas extracelulares (MSA). La tercera etapa es de infección o cuadro clínico propiamente tal (qPCR y ELISA positivos), se comienzan a acumular en el riñón proteínas extracelulares y el tejido infectado se vuelve positivo para ADN como antígeno bacteriano. Durante estas tres etapas se puede poner fin a la infección ya sea de manera natural o por medio de tratamientos y volver a las etapas anteriores. La cuarta etapa consiste en un estadio tardío del cuadro clínico (qPCR negativo y ELISA positivo), por lo tanto el daño al riñón ya es irreversible.

En la figura 5 podemos observar muestras de riñón con R. salmoninarum, en las diferentes etapas obtenidas de infecciones experimentales en condiciones controladas con el patógeno de peces R. salmoninarum en trucha arcoíris.

Es aceptado que la transmisión horizontal es un importante medio de difusión del BKD (Bell y col., 1990), sin embargo, la principal fuente de transmisión de la enfermedad, entre los salmónidos es la vertical, es decir, de padres a la progenie a través de los huevos (Evelyn y col., 1986). En la industria acuicultora se reduce el riesgo de transmisión vertical R. salmoninarum descartando los huevos de reproductores que han demostrado ser portadores del patógeno. A pesar de screening de reproductores, BKD sigue siendo el responsable de pérdidas significativas en el cultivo de salmónidos cultivados.

Debido a las características de la bacteria, la enfermedad y que los tratamientos no siempre son eficaces, existe gran información sobre diferentes metodologías de diagnóstico, desarrolladas con el fin de anticipar la presencia del agente en los peces. Las principales técnicas de detección e identificación del agente utilizadas para controles de rutina o screening son el Nested PCR (McIntosh y col., 1996; Pascho y col., 1998), qPCR (Powell y col., 2005; Chase y col., 2006; Jansson y col., 2008; Chambers y col., 2009; Halaihel y col., 2009), ELISA (Gudmundsdottir et al., 1993; Pascho y col., 1997; O’Connor y Hoffnagle 2007; Nance y col., 2010), IFAT (O'Halloran y col., 1994), histopatología (Bruno, 1985; Flaño y col., 1996) e inmunohistoquímica (IHQ).

En Chile la enfermedad está presente desde la década de los 80, sin embargo, es una patología que presenta alta morbilidad y baja mortalidad. Hoy en día es R. salmoninarum es considerado un agente altamente ubiquitario, con prevalencia variable dependiendo del uso de antibióticos y programas sanitarios. En zonas con alta prevalencia el BKD, se ha reducido por screening y eliminación de reproductores. El control de la enfermedad se realiza mediante tratamientos con eritromicina de manera inyectable y oral, pero tienen un efecto temporal sobre los peces (Austin, 1985; Bullock y Leek 1986; Evelyn y col., 1986; Lee y Evelyn 1994; Gudmundsdottir y col., 2000, Rhodes y col., 2008).

Estudios serológicos han demostrado la presencia de dos serogrupos (Bandin y col., 1992) un grupo mayoritario, incluida la cepa de referencia ATCC 33209T los cuales comparten un perfil de proteínas similar con un componente importa de 57 kDa y otro grupo minoritario que comparten un patrón común con una proteína de 30 kDa, determinado por de aglutinación en porta objetos, Dot–Blot y Western–Blot. Estudios de caracterización serológica y antigénica realizados en el laboratorio de investigación y desarrollo de Veterquímica, han determinado que en nuestro país se ha detectado la presencia de un solo grupo serológico mayoritario (Figura 6), el mismo representado por la cepa de referencia (Pedro Ilardi, comunicación personal).

Estudios de análisis filogenético mediante la secuenciación del gen 16S rRNA de los aislados nacionales, realizados en el laboratorio de investigación y desarrollo de Veterquímica, al compararlas con la cepa de referencia ATCC 33209T y dos clones disponibles en la base datos, han demostrado que comparten un 100% de similitud (Figura 7).

Experimentos de vacunación han tenido hasta ahora un progreso limitado (Kaattari y Piganelli 1997; Piganelli y col., 1999; Rhodes y col., 2004; Alcorn y col., 2005; Burnley y col., 2010). Pero la principal razón por la cual las vacunas no han progresado ha sido el hecho de que la enfermedad debe atacarse de forma temprana en los primeros estadios del desarrollo de los peces. Hasta el momento no existe una clara correlación entre la capacidad de producir respuesta inmune mediante anticuerpos contra R.salmoninarum, por parte de los peces vacunados con una bacterina (vacuna viva y atenuada) y la protección contra BKD. En la actualidad existe una vacuna comercial para la prevención de la enfermedad bacteriana del riñón, la cual es una vacuna de células vivas que contiene una bacteria (Arthrobacter sp.), que comparte determinantes antigénicos con R. salmoninarum. (Bravo y Midtlying., 2007). Se ha visto en estudios anteriores que peces vacunados con formulaciones de células completas de R.salmoninarum o aislados proteicos de ésta, pueden tener incluso una mayor susceptibilidad a BKD que grupos que no fueron vacunados (Pascho y col., 1997). La falta de protección podría ser explicada por la presencia de la proteína p57, ya que en peces a los que se les inyectó cepas de R. salmoninarum a las cuales se les había eliminado esta proteína mediante un tratamiento térmico a 37ºC por 10h, presentaban una mejor respuesta de anticuerpos que aquellos que se inyectaron con la bacteria tipo salvaje (Wood y Kaattari, 1996).

En Chile, el impacto productivo del BKD no está cuantificado, pero las pérdidas por mortalidad en agua dulce se ven reflejadas en el crecimiento, afectando a un estimado de hasta un 20% de la población aproximadamente, dependiendo de la especie (Intesal). En cuanto a las pérdidas por mortalidad en agua de mar, sí R. salmoninarum está presente y combinada con SRS, los peces se agravan, esto significa que hay retraso en el crecimiento, por lo tanto existe un mayor costo por alimentación y muerte por SRS más los costos de tratamiento de la enfermedad (inyección más tratamiento oral) del orden de US$ 750.000 por uso de antibióticos. Otro costo asociado son las pérdidas de reproductores positivos y del screening de estos (Pedro Ilardi, comunicación personal). Desde el año 2005 al 2014 los diagnósticos positivos a R. salmoninarum fueron en aumento en especial después de la crisis del virus ISA, donde se pasó de 25 casos el año 2009 a más de 300 el 2012 y una leve disminución el 2014. De acuerdo a estos datos la especie más susceptible en nuestro país es el salmón coho (O. kisutch) seguido por el salmón del Atlántico (S. salar) y menor medida la trucha arcoíris (O. mykiss) y además la zona con mayor número de diagnósticos por especie es la XI región, donde se concentran los cultivos de engorda en mar, seguida por la X región, como se puede apreciar en las figuras 8 y 9.

En conclusión R. salmoninarum es un patógeno altamente ubiquitario dentro de los planteles, afectando a todas las especies de salmónidos cultivadas en Chile. Además representa un riesgo para el cultivo, ya que por las características de la enfermedad en nuestro país resulta en un daño permanente y crónico uno de los principales órganos encargados de la respuesta inmune del pez, el riñón. Es por esta razón que el control y prevención de la enfermedad a través del screening y durante el alevinaje cobra vital importancia para reducir la prevalencia del BKD en los cultivos y generar smolts de calidad y libres del patógeno de peces R. salmoninarum.

 

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el proyecto Corfo de innovación empresarial de rápida implementación 11 IERI–11965. Se agradece la colaboración y contribución a los miembros del equipo técnico de los laboratorios de Veterquímica, en especial a Juan Battaglia.

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