Mejoramiento genético en salmónidos: Selección genómica de candidatos resistentes a Caligus rogercresseyi

Caligus rogercresseyi ha constituido por muchos años uno de los problema sanitarios más importantes durante la fase de engorda de los salmones cultivados en Chile. La infestación por C. rogercresseyi usualmente no genera una muerte directa de los peces, pero se ha observado que produce estrés, desequilibrio osmótico, disminución del apetito, inmunodepresión y daño a nivel de la piel (Furci, 2009¹), y puede constituir un factor preponderante en el aumento de la susceptibilidad de los salmones a otras enfermedades (Pike y Wadsworth, 1999²).

La mayoría de las características de importancia económica, incluyendo la resistencia a enfermedades, están bajo el control de un elevado número de genes (herencia poligénica) que se distribuyen como caracteres cuantitativos y continuos producto de la segregación de varios loci, cuya expresión puede ser modificada por el cambio en la frecuencia de los genes de una población, a través del uso de los programas de mejoramiento genético (Cook, 1993³).

En Chile existen empresas que, dentro de los objetivos de sus programas de mejoramiento genético, han incorporado la resistencia a C. rogercresseyi. Es el caso de las empresas de genética como Aquagen Chile (a través del consorcio Blue Genomics), Aquainnovo, Marine Harvest Chile, Los Fiordos y Landcatch (perteneciente al holding Hendrix Genetics), quienes están realizando investigación de primer nivel para lograr avanzar en el conocimiento de la genética en salmón Atlántico y trucha arcoíris y obtener, en el corto plazo, peces resistentes a Caligus.

Líneas de trabajo genético

La empresa Blue Genomics, en conjunto con Aquagen Chile, están en la búsqueda de marcadores genéticos para la resistencia de Caligus en salmón Atlántico y trucha arcoíris, con el objeto de, una vez encontrados, comenzar a realizar una selección asistida por marcadores o una selección genómica. "En Chile, en ambas especies nos encontramos en la etapa de identificación de marcadores mediante el uso de SNP chips, luego de haber evidenciado una alta variabilidad genética a este carácter en las familias que mantiene Aquagen Chile, explicó el gerente del consorcio Blue Genomics, Matías Medina, aclarando que los marcadores encontrados en Noruega no necesariamente están asociados con los mismos genes de resistencia para la especie de piojo de mar en Chile.

En tanto, la empresa Aquainnovo actualmente está implementando un chip de marcadores SNPs (Single Nucleotide Polimorfism) de ADN que detecta peces que son más resistentes frente a C. rogercresseyi. "La selección fenotípica es un primer nivel de implementación de una estrategia para hacer resistencia a Caligus, pero hoy sabemos que esta estrategia es poco eficiente, por ello, también hemos desarrollado herramientas moleculares que aportan más información genética para hacer más eficiente este proceso de selección ", detalló el gerente de Desarrollo de Aquainnovo, Jean Paul Lhorente.

A su vez, la empresa Los Fiordos tiene un programa de mejoramiento genético en base a selección individual y familiar y, desde el año 2012, se encuentran trabajando en identificar y seleccionar familias de salmón Atlántico menos susceptibles a Caligus. "Junto con Landcatch hemos incorporado un QTL para identificar reproductores que tienen mayor grado de robustez durante desafíos de Caligus. Además, a nivel individual, estamos incorporando la utilización de un chip de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) en el núcleo genético, para realizar selección genómica de los candidatos reproductores", reveló el subgerente de Reproductores de Los Fiordos, Claudio Cumsille.

En Marine Harvest Chile, si bien se encuentran trabajando e investigando soluciones que puedan controlar la Caligidosis, aún no tienen una herramienta genética aplicada en la producción. "Las líneas de trabajo genético, referente a control de Caligus, deben ser ampliamente investigadas, de manera que no afecten los otros rasgos que están actualmente bajo selección", puntualizó el gerente de Reproducción y Genética de Marine Harvest Chile, Robert Deerenberg.

Asimismo, Landcatch, empresa escocesa que tiene una larga historia en la investigación de la genética de la resistencia de los piojos de mar (tanto en L. salmonis como en C. rogercresseyi) en salmón Atlántico, comenzó a trabajar con datos de campo y estudios de desafíos a partir del año 2006. Según comentó el director de genética de la empresa, Alan Tinch, la selección familiar se ha utilizado para mejorar la resistencia durante varios años en la cepa Landcatch. A partir de este año, se encuentran realizando selección genómica de los candidatos reproductores en Chile, usando miles de marcadores moleculares a través de un chip de SNPs (35k).

Evaluación de la resistencia a Caligus

La selección de los reproductores resistentes a Caligus se realiza mediante desafíos experimentales en estanques, donde se mide como variable respuesta el número de Caligus adherido al pez, que puede ser medido en estado sésil (Chalimus I, II, III) o estado móvil. Esta medición da cuenta de la capacidad del pez de no infestarse o, si el parásito se adhirió al pez, de la capacidad de eliminarlo con una reacción inflamatoria especifica. También hay empresas que complementan esta información realizando evaluaciones cualitativas en planta de proceso, donde se mide cualitativamente el nivel del daño generado por los piojos. Toda esta información se mide en base al grupo hermano de peces del núcleo y, por lo tanto, se puede utilizar sólo a nivel familiar.

En general, las empresas trabajan con poblaciones con genealogía conocida, identificadas con PIT tags (PIT: Passive Integrate Transponders), lo que permite implementar un diseño estadístico con réplicas (estanques). "En Aquainnovo no sólo se mide el número de Caligus por pez, también realizamos mediciones de peso, largo y ancho del pez, con el objetivo de corregir ese fenotipo por el tamaño del pez, ya que el tamaño del pez influye en el número de parásitos que presentan. De esta forma, se puede utilizar, como variable respuesta, el número de parásitos por pez o por unidad de superficie, lo cual estandariza el tamaño", explicó Lhorente. En este contexto, el representante de Marine Harvest Chile indicó que en el país también han desafiado peces en un ambiente controlado, con el objetivo de eliminar la mayor cantidad de variables del análisis. "Estamos en una fase de definición, respecto con la mejor forma para medir el rasgo, ya que la calidad de la medición define la calidad de nuestros cálculos", expresó Deerenberg.

En tanto, en Los Fiordos realizan dos tipos de evaluaciones, "primero se trabaja con el nivel del daño de Caligus en planta de proceso, con los grupos centinelas (peces hermanos del núcleo del programa genético que ha crecido en condiciones productivas en el mar) y, por otro lado, se hacen conteos de Caligus (todos los estadios) en grupos de ensayo, que son hermanos de los reproductores", reveló Cumsille.

Si bien los resultados de campo tienden a mostrar una mayor variación que los ensayos de desafío, el representante de Landcatch cree que este tipo de desafíos puede estar más relacionado con la situación real experimentada por el salmón durante la producción comercial. "Una combinación de ambos enfoques puede llegar a ser el método óptimo de predecir la susceptibilidad", puntualizó Tinch.

No obstante, según Lhorente, a pesar que hay cierta evidencia respecto que la correlación entre individuos resistentes en condiciones productivas y experimentales es alta, ésta no ha sido profundamente estudiada. "Nosotros hemos mostrado evidencia que, familias que responden de cierta forma en condiciones experimentales, pueden cambiar su ranking frente a distintas expresiones de infestación que pueden ocurrir en condiciones productivas, pero para ello se debe pesquisar la respuesta en diferentes condiciones ambientales", reveló el investigador.

Avances en la resistencia a Caligus: selección genómica

Para la resistencia al piojo de mar, la selección genética había sido siempre realizada sobre la base de información de las familias en las pruebas de desafío. Por lo tanto, sólo estaban seleccionadas las mejores familias, sin saber mucho acerca de las características de los reproductores individuales. Actualmente, con la secuenciación del genoma del salmón Atlántico y trucha arcoíris, las empresas de genética, a través de la selección genómica, han comenzado a calcular los valores genéticos para la selección de reproductores resistentes a Caligus, utilizando la información de un gran número de marcadores de ADN. A diferencia de la selección fenotípica, con esta técnica se utilizan los peces del núcleo del programa para calcular el valor genético individual (gEBV) de cada candidato a reproductor.

Es así como Aquainnovo, recientemente, ha desarrollado un chip de marcadores moleculares del tipo polimorfismos de nucleótidos únicos (SNPs) para el salmón Atlántico, que tiene 50.000 marcadores (50k). "Al extraer ADN de esos individuos, conociendo el fenotipo y genotipo y, a través del Chip de SNPs, somos capaces de validar la estructura genética del carácter, si es poligenético o si tiene genes de efecto mayor o QTLs de importancia, como en el caso de IPN", explicó Lhorente, añadiendo que "para Caligus sabemos que es de carácter poligenético, por lo tanto, se debe utilizar un gran número de marcadores y, por cada marcador, se obtiene un genotipo, obteniéndose así 50 mil genotipos diferentes, con los cuales podemos reconstruir el valor genético para resistencia a Caligus en cada reproductor candidato en forma eficiente ".

En cuanto a la precisión del valor genético entregado por este chip de SNPs, Lhorente dijo que "si se compara con el valor genético de un reproductor en base a su valor genético familiar, que se obtiene solo de los desafíos realizados, va a tener un nivel de precisión cercano a un 30-40%, pero si se reconstruye ese valor genético con los 50 mil genotipos obtenidos del

Chip de SNPs, la eficiencia o la precisión de ese valor genético puede llegar a ser el doble o más, por lo tanto, la ganancia que se puede obtener es mayor", reveló Lhorente.

En tanto, el trabajo que desarrolla Los Fiordos está enfocado al análisis de estimación de heredabilidad del carácter, a los cálculos de correlación genética con otros rasgos, a la definición de la mejor forma de medición y a la repetición de los desafíos. "Además, comenzaremos con un análisis al nivel de genética molecular, para que en el futuro cercano podamos implementar selección asistida por marcadores o, por lo menos, selección genómica, donde, a nivel intra familiar, encontremos individuos que tengan un perfil genético muy parecido a sus hermanos, con un buen performance durante los desafíos", reveló Cumsille.

En el año 2014, Landcatch genotipó los primeros candidatos reproductores utilizando un chip de 35k en Escocia."Por primera vez, los reproductores podían ser seleccionados mediante un valor individual para la resistencia del piojo de mar en Escocia, con esto estimamos que las ovas comerciales tendrán un 10% más resistencia a los piojos de mar. Además, pudimos estimar que el mejoramiento de la resistencia a los piojos de mar, usando selección genómica, es un 28% más eficaz que selección que utiliza sólo información familiar", comentó Tinch.

Desafíos de los programas de mejoramiento genético

Según Deerenberg, para Marine Harvest Chile el desafío más importante, a corto plazo, es encontrar una herramienta eficiente para seleccionar individuos resistentes a Caligus. "Con el objetivo anterior logrado, se escalará esta herramienta a nivel de producción, en forma gradual, sin que afecte en forma no deseada los demás rasgos genéticos que son importante para la empresa" precisó.

En el caso de Los Fiordos, Cumsille dijo que el principal desafío de la empresa es llevar los conocimientos y tecnologías que existen actualmente a la producción de ovas, de forma rápida y eficiente. "Lograr identificar los candidatos más resistentes a Caligus es el principal objetivo, y creemos que la mejor forma de hacerlo es mediante selección genómica", dijo el ejecutivo.

En este contexto, Tinch declaró que la resistencia del parásito es muy compleja, ya que, aún cuando se ha demostrado que es hereditaria, está bajo el control de muchos genes. La selección genómica es una herramienta para mejorar la precisión y la eficacia de la selección, pero entregará mejoras evidentes en varias generaciones más. Además, agregó el ejecutivo, el desafío ahora es aplicar esta tecnología con un enfoque equilibrado, con el objeto de asegurar los progresos paralelos con otros rasgos de importancia productiva.

Respecto del genotipado y su aplicación en los Chip de SNPs, Lhorente dijo que es un área compleja y un desafío que impone la enfermedad, debido al carácter poligénico del carácter, la respuesta en resistencia se puede estar dando en varias vías de defensa de los peces”. "Hay muchos genes interactuando, por lo que la resistencia a Caligus pueda estar dada por uno o por la combinación de ellos. Hoy no hay un único candidato, por lo que se requiere avanzar hacia una selección genómica en que se busca la combinación de diferentes SNPs".

Otro de los grandes desafíos que visualiza Lhorente es reducir los costos del genotipado a través de la generación de un chip de menor densidad (LDP: Low Density Panel). "Actualmente, la genotipificación de 50k para cada individuo tiene un costo alto, que va desde los US$ 60 a US$ 80 por cada muestra, por lo tanto, nuestro esfuerzo está enfocado en saber elegir cuáles de esos 50.000 puntos predicen el valor genómico de la población, para ello se debe identificar los marcadores y reducir su número en el chip de SNPs, sin afectar el nivel de precisión", dijo el investigador agregando que "de esta manera, podremos generar un chip de SNPs hecho a la medida, cuyo costo va a disminuir considerablemente, pudiendo llegar hasta los 15 dólares, y por lo tanto, facilitar su implementación a nivel productivo".

En tanto, los desafíos que tiene Blue Genomics pasan principalmente por analizar y luego validar los resultados que hemos obtenido en relación a la variabilidad genética al interior de la población de AquaGen y en la asociación de esta variabilidad a posibles marcadores genéticos. Sin embargo, para poder obtener resultados contundentes, es preciso utilizar un diseño y metodologías adecuados. En esto también hemos avanzado, tenemos un sistema estandarizado para hacer los desafíos y para determinar quiénes son los individuos susceptibles y cuáles los resistentes", dijo Medina.

En este sentido Lhorente resaltó que si bien Aquainnovo tiene un Chip de SNPs validado con el fenotipo de resistencia a Caligus, esto no significa que sea la única solución al problema y aseveró que el manejo de Caligus tiene que ser complementario con otras estrategias que se pueden utilizar. "La resistencia a Caligus es eficiente cuando los peces se ven expuestos a presiones de infestación al parásito razonables. Si se cultivan individuos resistentes a una condición máxima de presión de infestación, éste igual se va a infectar y va a causar problemas, y esto para cualquier patógeno. Hay que manejar conceptos epidemiológicos y de bioseguridad para que la resistencia a este patógeno funcione adecuadamente".

En conclusión, la adecuada implementación de un programa de mejoramiento genético animal debe considerar la utilización de herramientas genéticas cuantitativas y moleculares para maximizar el impacto esperado. Del mismo modo, el progreso genético como consecuencia de este plan, sólo será posible mediante un adecuado manejo reproductivo y/o la aplicación de biotecnologías reproductivas (i.e. criopreservación) que permitan transferir el progreso genético alcanzado a un mayor número de productores y en un menor tiempo. Sin embargo, la mejora genética es parte de un enfoque multifactorial para el control de Caligus que también incluirá medicamentos, vacunas, nutrición, manejos, etc.