Caracterización de Vesículas

Introducción

Piscirickettsia salmonis es una bacteria Gram negativa, intracelular facultativa y perteneciente a la familia Piscirickettsiaceae. Este microorganismo es el agente causante de la Septicemia Rickettsial del Salmon (SRS) o piscirickettsiosis, la cual es una enfermedad sistémica que afecta a las principales especies de salmónidos de cultivo en Chile (Rozas y Enríquez, 2014). El patógeno fue aislado por primera vez desde un salmón Coho (Oncorhynchus kisutch) moribundo en un centro de cultivo del sur de Chile en el año 1989, siendo desde entonces, reportada en otras regiones del hemisferio norte como Canadá, Irlanda, Noruega y Escocia entre otros (Fryer y Hedrick, 2003). Sin embargo, hoy en día sólo se describen altas mortalidades en centros de cultivo de nuestro país.

A pesar de que la ruta de entrada de este patógeno en los peces no ha sido completamente dilucidada, se sabe que P. salmonis es capaz de infectar y multiplicarse dentro de células macrofa?gicas (Rojas y col., 2009), generando un reordenamiento del citoesqueleto de actina (Ramírez y col., 2015) y se replica al interior de grandes vacuolas citoplasmáticas de la célula hospedera (Smith y col., 2010), donde, posteriormente, la célula hospedera es destruida y las bacterias contenidas en su interior son liberadas hacia el extracelular, para infectar otras células vecinas (Rojas y col., 2010). Sin embargo, los mecanismos moleculares involucrados en la virulencia de P. salmonis no están completamente entendidos.

Los sistemas de secreción son mecanismos bien caracterizados y son utilizados por las bacterias para liberar proteínas efectoras y/o toxinas hacia el medio ambiente o hacia el citoplasma de la célula hospedera. Así, investigaciones recientes describen que P. salmonis posee todos los genes del sistema de secreción tipo IV (Pulgar y col., 2015; Yáñez y col., 2014). En otras bacterias, como Legionella pneumophila, el sistema de secreción tipo IV transporta proteínas efectoras que contribuyen a la patogénesis in vivo. Sin embargo, la funcionalidad de este sistema de secreción, y/o de las proteínas efectoras, no ha sido del todo bien caracterizada en P. salmonis.

Por otra parte, las bacterias Gram-negativas también poseen mecanismos alternativos para secretar proteínas y compuestos tóxicos, mediante la formación de pequeñas estructuras esféricas (10-300 nm en diámetro), denominadas vesículas de membrana interna (OMVs, por su sigla en inglés). Así, se ha descrito que estas vesículas están principalmente compuestas por proteínas de la membrana externa (OMPs, por su sigla en inglés), lipopolisacáridos (LPSs), fosfolípidos, y proteínas del espacio periplasmático, y muy baja o nula cantidad de proteínas de la membrana interna y componentes citoplasmáticos. De esta forma, OMVs pueden también contener y estar enriquecidas de toxinas y factores de virulencia bacterianos, los que pueden ser liberados hacia el citoplasma de la célula hospedera, ya sea a través de la fusión con la membrana plasmática o internalizadas mediante rutas endocíticas (Bomberger y col., 2009).

La producción de OMVs por otras bacterias Gram negativas estrechamente relacionadas con P. salmonis ha sido descrita en Francisella novicida (Pierson y col., 2011), L. pneumophila (Jäger y Steinert, 2013), y los patógenos de peces Francisella noatunensis (Bakkemo y col., 2011) y Vibrio anguillarum (Hong y col., 2009). Sin embargo, no hay estudios en relación a la producción y la citotoxicidad de OMVs de P. salmonis. De esta manera, este trabajo se enfocó en investigar la producción de OMVs por P. salmonis y evaluar in vitro una posible asociación entre estas OMVs y la patogénesis de esta bacteria.

Mediante el proyecto postdoctoral Fondecyt 3160849 y Fondap 15110027 se realizó la purificación y caracterización de OMVs de P. salmonis. Para ello, bacterias fueron crecidas en un medio de cultivo líquido. Utilizando este medio, se diseñó un protocolo de purificación de OMVs de P. salmonis desde el sobrenadante de cultivo. Así, se evaluó la presencia de OMVs en el sobrenadante y en un proceso infeccioso en células CHSE-214 mediante análisis de microscopía electrónica de transmisión y barrido. Asimismo, se analizaron y cuantificaron las OMVs en cuanto a morfología y tamaño. Finalmente, de analizó la capacidad de las OMVs de generar citotoxicidad en células CHSE-214, la que se analizó mediante microscopia de luz.

Resultados

Para evaluar la producción de OMVs por P. salmonis, se utilizó la línea celular CHSE-214, las cuales fueron infectadas con bacteria viable y se analizó el proceso infeccioso a diferentes tiempos post-infección, mediante microscopía electrónica. Así, fue posible observar pequeñas estructuras esféricas ubicadas muy cercanas a la membrana externa de la bacteria, al interior de la vacuola citoplasmática (Figura 1A y 1B). El análisis de microscopía electrónica de transmisión mostró claramente estructuras que protruyen, desde la membrana externa de la bacteria en cultivo (Figura 1C) hasta OMVs recién liberadas (Figura 1D). Del mismo modo, mediante microscopía electrónica de barrido fue posible identificar estas OMVs liberadas desde P. salmonis en cultivo (Figura 1E y 1F). Las OMVs fueron aisladas desde el sobrenadante de cultivo de P. salmonis, y mediante tinción negativa fue posible visualizar en el microscopio electrónico que las OMVs eran estructuras esféricas y muy variadas en tamaño (Figura 2A y 2B). Así, se midió el diámetro de 2.020 vesículas individuales, arrojando diámetros entre 25-145 nm, donde 660 OMVs (33%) presentaron un diámetro de 45.5 nm. Como se muestra en la  Figura 2C, la mayoría de las OMVs presentó un diámetro entre 30 y 50 nm, aproximadamente.

Figura 1. Microscopía electrónica de OMVs de Piscirickettsia salmonis (A) imagen de TEM OMVs liberadas desde P. salmonis dentro de una vacuola de una célula CHSE-214. Barra de magnificacion: 200 nm. (B) imagen de TEM images muestra la presencia de OMVs en el sobrenadante de células infectadas por un largo periodo de tiempo con P. salmonis. Barra: 500 nm. Ps: P. salmonis. Las cabezas de flecha indican la presencia de OMVs. (C) formación de una OMV desde una P. salmonis crecida en medio basal. Barra: 100 nm. (D) OMVs liberadas desde P. salmonis. Barra: 100 nm. (E) imagen de SEM de OMVs siendo liberada por P. Salmonis crecida en agar. La flecha indican una OMV sobresaliendo desde una bacteria. (F) OMVs liberada por P. salmonis crecida en agar. Barra: 1 ?m.

Figura 2. OMVs purificadas desde P. salmonis crecida en medio líquido. (A) imagen de TEM de OMVs purificadas desde el sobrenadante de cultivo de P. salmonis libre de células. Barra: 1 ?m. (B) Magnificación de OMVs purificadas desde P. salmonis. Barra: 50 nm. (C) distribución de tamaño de OMVs purificadas desde P. salmonis.

Adicionalmente, para analizar el perfil proteico de las OMVs aisladas desde P. salmonis, se realizó una comparación entre las fracciones de OMV y OMP de P. salmonis mediante electroforesis. El análisis mostro un patrón proteico similar entre las dos fracciones, con sólo unas pocas bandas proteicas diferencialmente representadas (Figura 3A). El perfil de OMVs mostró tres bandas muy distintas, de aproximadamente 25, 100, y 210 kDa, las cuales no estuvieron presentes en las OMP. Adicionalmente, proteínas de 72 y 48 kDa fueron las mas abundantes en la fracción de OMVs de P. salmonis.

Figura 3. Análisis de OMVs purificadas desde P. salmonis LF-89. (A) Perfil de proteínas totales (carril 1) de P. salmonis mediante SDS-PAGE, OMPs (carril 2), y OMVs (carril 3). Flechas negras en las OMVs indican las bandas proteicas ausentes en la fracción OMPs. Flechas rojas indican las bandas proteicas más abundantes en la fracción OMVs. Bandas proteicas utilizadas para análisis de LC-MS/MS están indicadas con letras (A, B, C, D, E). El paréntesis cuadrado indica la banda del gel utilizada para el análisis de LC-MS/MS de Hsp60. M: estándar de peso molecular. (B) Western blot de proteínas totales de E. coli, usado como control (carril 1), proteínas totales de P. salmonis (carril 2), OMPs (carril 3), y OMVs (carril 4) analizado con un anticuerpo anti-Hsp60. M: estándar de peso molecular.

Por otra parte, un objetivo importante de este estudio fue identificar distintos factores de virulencia contenidos en las OMVs de P. salmonis. El análisis de Western blot, utilizando un anticuerpo específico anti-Hsp60, permitió identificar a esta proteína. Así, Hsp60 fue detectada como una única banda en las fracciones de OMV y OMP, al igual que en las proteínas totales y en un extracto proteico de Escherichia coli usado como control (Figura 3B). La presencia de Hsp60 en las OMVs de P. Salmonis fue confirmada mediante un análisis de espectroscopía de masa LC-MS/MS de bandas desde el gel SDS-PAGE cortadas y digeridas con tripsina. Así, se identificaron 18 péptidos únicos con una cobertura de 57,88% de la secuencia aminoacídica de Hsp60 de P. salmonis. Adicionalmente, se identificaron algunas de las proteínas más abundantes en las OMVs de P. salmonis (Tabla 1), entre ellas, otras chaperonas como DnaK (Hsp70) y HtpG (Hsp90); varias proteínas no caracterizadas; proteínas involucradas en conjugación bacteriana, como TrbI, TrbE, CagE, y VirB; proteínas involucradas en la captura de fierro, bacterioferritina; y el factor de virulencia proteína de membrana externa A (OmpA, por su sigla en inglés).

Figura 4. OMVs de P. salmonis LF-89 induce efecto citopático en células CHSE-214. (A) Control, monocapa de células CHSE-214 no tratadas, (B) células tratadas con 20 ?g/?L de OMVs, (C) células infectadas con P. salmonis, y (D) células tratadas con sobrenadante de cultivo líquido de P. salmonis por 48 h. La morfología celular fue analizada mediante microscopía de luz.

Finalmente, para determinar el efecto de OMVs de P. salmonis OMVs sobre las células hospederas, se evaluó la citotoxicidad de las vesículas en la línea celular CHSE-214. Así, cantidades crecientes de vesículas purificadas, desde el sobrenadante de cultivo de P. salmonis en fase estacionaria temprana, fueron añadidas a las células y la morfología fue analizada mediante microscopía óptica. Después de 48 h de incubación, se evidenciaron fuertes alteraciones morfológicas en las células, como elongación y desprendimiento celular con todas las concentraciones de OMVs utilizadas (Figura 4B), a diferencia de las células no incubadas con OMVs (Figura 4A). Estos efectos fueron similares a los observados cuando las células fueron incubadas con sobrenadante de cultivo libre de bacterias (Figura 4D). No obstante, el daño celular producido por las OMVs fue muy diferente al daño generado por la bacteria viva, cuyas células hospederas mostraron la típica vacuolización citoplasmática (Figura 4C). Estos resultados sugieren que  las OMVs purificadas son biológicamente activas y podrían contener factores de virulencia involucrados en la patogénesis de P. salmonis.

Discusión

OMVs parecieran ser producidas por todas las bacterias Gram-negativas como parte de su crecimiento normal (Deatherage y col., 2009). En este estudio, describimos por primera vez la purificación y caracterización de OMVs de Piscirickettsia salmonis. Así, P. salmonis libera OMVs durante su replicación intracelular y, además, OMVs purificadas inducen efecto citopa?tico en células CHSE-214.

Cuatro días después de la infección, P. salmonis intacta fueron encontradas dentro de vacuolas en el citoplasma celular. Así, pequeñas vesículas fueron observadas cercanas a las bacterias y algunas de ellas unidas a la membrana bacteriana, similar a lo reportado por McCarthy y col. (2008). Adicionalmente, análisis de TEM de P. salmonis revelaron la formación de OMVs, lo cual se correlaciona con lo descrito para Flavobacterium psychrophilum (Møller y col., 2005). Los mismos autores observaron un fuerte incremento en la formación de OMVs cuando las bacterias fueron crecidas bajo condiciones limitadas de hierro, similar a lo descrito en Pseudomonas aeruginosa al ser expuesta a gentamicina (Kadurugamuwa y Beveridge, 1995).

En el presente estudio, gran cantidad de OMVs fueron purificadas desde sobrenadante de cultivo líquido de P. salmonis, la cual fue crecida en un medio mínimo. Esto indica que ciertos factores de estrés, como la falta de nutrientes esenciales (hierro y cisteína), podrían incrementar la formación de OMVs de P. salmonis. Asimismo, las OMVs purificadas fueron esféricas, similares a las vesículas aisladas desde V. anguillarum (Hong y col., 2009), F. noatunensis (Bakkemo y col., 2011), F. novicida (Pierson y col., 2011), y L. pneumophila (Ja?ger y Steinert, 2013), siendo además, las OMVs de P. salmonis muy diversas en tamaño con 25-145 nm en diámetro, similar al tamaño descrito en otras bacterias Gram-negativas (Deatherage y col., 2009).

A su vez, el análisis de LC-MS/MS reveló que la proteína más abundante encontrada en las OMVs (46,2 kDa) fue una proteína aún no caracterizada en P. salmonis. Esta proteína podría ser una OMP, debido a su abundancia en el extracto OMP y no así en el extracto de proteínas totales. Adicionalmente, análisis de Western blot y LC-MS/MS permitieron determinar que Hsp60 está presente en las OMVs de P. salmonis, lo cual esta de acuerdo con lo encontrado para Hsp60 cuando OMVs de Francisella philomiragia y F. novicida (Pierson y col., 2011), Acinetobacter baumannii (Kwon y col., 2009), y Helicobacter pylori (Gobert y col., 2004) fueron analizadas por espectrometría de masa. Asimismo, investigaciones recientes indican que Hsp60 de Francisella tularensis provoca una fuerte respuesta inmune en macrófagos humanos (Noah y col., 2010). Del mismo modo, una vacuna generada con Hsp60 y otras proteínas recombinantes de P. salmonis incrementó la protección frente a un desafío con esta bacteria (Wilhelm y col., 2006). Así, la presencia de Hsp60 en la membrana externa de P. salmonis se correlaciona con su presencia en las OMVs, lo que podría explicar el fuerte efecto protector previamente descrito por Wilhelm y col. (2006).

Análisis de LC-MS/MS permitieron identificar a las chaperonas DnaK (Hsp70) y HtpG (Hsp90), involucradas en el plegamiento de proteínas descrito por Pierson y col. (2011). Específicamente, HtpG es una proteína biológicamente activa requerida por E. tarda para lidiar con las condiciones estresantes durante un proceso infeccioso in vivo (Dang y col., 2011). Otras proteínas interesantes identificadas fueron la proteína de tolerancia a solventes orgánicos (OstA, 94,2 kDa), la cual es esencial para la biogénesis de la envoltura celular y el ensamble de LPSs en la cara externa de la membrana externa bacteriana (Hu y Saier, 2006); proteínas involucradas en transferencia de material genético por conjugación (TrbI, TrbE); y varias proteínas de membrana.

Finalmente, se evaluó la capacidad de generar efecto citopa?tico de las OMVs purificadas desde P. salmonis en células CHSE-214. Así, las OMVs de P. salmonis indujeron cambios morfológicos en las células hospederas, como elongación y desprendimiento celular. Estos cambios fueron similares a observaciones reportadas en células Cos-7 tratadas con OMVs de A. baumannii (Kwon y col., 2009). Del mismo modo, Rojas y col. (2013) describieron que el sobrenadante de cultivo libre de P. salmonis generó  efecto citopa?tico en células CHSE-214 y ASK como consecuencia de la producción de una exotoxina bacteriana. Sin embargo nosotros observamos que, sobrenadante y OMVs purificadas generaron cambios morfológicos similares en la monocapa celular, indicando que las OMVs podrían tener participación en el transporte de toxinas y en la patogénesis de la Piscirickettsiosis.

Conclusión

P. salmonis es capaz de producir OMVs durante su crecimiento in vitro, así como también durante una infección del hospedero. OMVs purificados desde P. salmonis inducen efecto citopa?tico en células CHSE-214, lo cual indica fuertemente que las vesículas transportan factores de virulencia y toxinas. Finalmente, Hsp60 y la compleja mezcla de proteínas contenidas en las OMV definitivamente juegan un papel en los mecanismos virulencia de P. salmonis. Además, nuestros resultados nos permiten sugerir que al igual que otras bacterias Gram negativas, el contenido proteico y la cantidad de determinadas proteínas clave de las OMVs podrían permitir diferenciar la virulencia de distintas cepas P. salmonis.

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