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Efecto en la migración de neutrófilos por activación del sistema inmune innato inducido por vacunas contra Flavobacterium psychrophilum en pez cebra

Carmen G. Feijóo1,2, Ariel E. Reyes1,2, Camila J. Solís1,2, Rubén Avendaño-Herrera1,2,3

1 Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Andrés Bello.

2 Interdisciplinary Center for Aquaculture Research, Fondap Incar.

3 Centro de Investigación Marina Quintay, CIMARQ.

 

Introducción

Flavobacterium psychrophilum (Bernardet y col., 1978), es una bacteria Gram negativa, filamentosa con movimiento deslizante, sicrófila y perteneciente a la familia Flavobacteriaceae. Este microorganismo es el agente causante de la enfermedad del agua fría y el síndrome del alevín de la trucha arcoíris en cultivos de salmónidos en el mundo (Nematollahi y col., 2003; Barnes y col., 2011). En Chile, su presencia se describió en la industria acuícola por primera vez el año 1993, y su incidencia sólo ha aumentado desde entonces (Bustos y col., 1995; Avendaño- Herrera y col., 2009). A pesar del severo impacto que presenta esta enfermedad, las terapias antimicrobianas son el único método disponible para controlar esta condición en los peces cultivados. Entre los años 2006 y 2009, se ha estimado que 55 toneladas de florfenicol y oxitetraciclina se han utilizado en la salmonicultura chilena para controlar los brotes de este patógeno (Henríquez-Núñez y col., 2012). En Chile, actualmente se aplica una vacuna comercial de inmersión, cuya eficacia para su registro comercial se evaluó en desafíos donde el patógeno se inyectó directamente al pez, pasando por alto el importante efecto protector de las mucosas, una de las mayores defensas del pez ante una infección.

La clave para una inmunización eficiente y una potente generación de anticuerpos específicos, se basa en asegurar una presentación antigénica eficaz por las células del sistema inmune innato. Este evento gatilla la respuesta antígeno-específica por parte del sistema inmune adaptativo, lo que llevará a la producción de anticuerpos específicos contra el patógeno invasor (Iwasaki y col., 2004).

Los leucocitos activados, o aquellos que no se encuentran en la circulación, estarán involucrados en dar inicio a la respuesta inmune adaptativa (Mantovani y col., 2011). Estudios recientes han establecido que existen variados factores de la respuesta inmune innata que dan paso a la respuesta adaptativa (Balazs y col., 2002; Scapini y col., 2003; Schwaller y col., 2007; Mantovani y col., 2011; Puga y col., 2012; Mócsai, 2013). Por ejemplo, los neutrófilos del bazo facilitan la respuesta de anticuerpos en la zona marginal de los linfocitos B al antígeno microbiano (Mócsai, 2013). Estos granulocitos promueven la sobrevivencia del linfocito B, así como la producción de inmunoglobulinas del tipo IgM, IgG e IgA (Mócsai, 2013; Cerutti y col., 2013).

Durante la última década, el pez cebra se ha posicionado como un potente modelo para el estudio de inmunología tanto de peces como mamíferos (Barut y col., 2000; Van der Sar y col., 2004; Swaim y col., 2006; Lieschke y Currie, 2007; Sullivan y Kim, 2008). Alguna de las ventajas que presenta este modelo son la disponibilidad de su genoma secuenciado y la transparencia de embriones así como de larvas, que facilitan el monitoreo de una infección o proceso inflamatorio in vivo, entre otros (Laale 1977; Kimmel y col., 1995; Traver y col., 2003; Sullivan y Kim 2008; Lieschke y Trede, 2009; Allen y Neely, 2010).

A través del proyecto de investigación de la Universidad Andrés Bello Núcleo DI- 447-13/N y FONDAP 15110027 se realizó la comparación del efecto de vacunas formuladas para F. psychrophilum en la activación del sistema inmune innato utilizando al pez cebra. Para ello, larvas de pez cebra fueron vacunadas por inmersión con dos cepas de bacterias inactivadas (LM-02-Fp y LM-13-Fp) por calor (VAC) o con formaldehido (VAF) con o sin adyuvante. El medio de cultivo de crecimiento de las bacterias fue triptona extracto de levadura y sales (TYES), siendo el control negativo el mismo TYES, pero sin bacteria. Se monitoreó la presencia de leucocitos en un área definida, dado que éstos son los primeros en infiltrarse en un tejido dañado (Rogers y col., 1994; Pedrosa y col., 2000; Appelberg, 2007; Saitoh y col., 2012). Para llevar a cabo esto, se utilizó una línea transgénica que tiene los neutrófilos marcados con fluorescencia verde y se determinó la migración de éstos como marcador del efecto de la vacunación sobre el sistema inmune innato.

 

Resultados

Figura 1. A las 48 horas postfertilización, se realizó la selección de larvas de pez cebra Tg(mpx:GFP) i114 no activadas, cuyos neutrófilos se encontraban exclusivamente en el tejido caudal hematopoyético (TCH, Recuadro azul). Se incubaron por inmersión durante un minuto con las diferentes formulaciones y se cuantificaron los neutrófilos movilizados a la región de interés (RDI, recuadro rojo) a las 2, 4, 6 y 8 horas post inmersión (hpi).
Figura 1. A las 48 horas postfertilización, se realizó la selección de larvas de pez cebra Tg(mpx:GFP) i114 no activadas, cuyos neutrófilos se encontraban exclusivamente en el tejido caudal hematopoyético (TCH, Recuadro azul). Se incubaron por inmersión durante un minuto con las diferentes formulaciones y se cuantificaron los neutrófilos movilizados a la región de interés (RDI, recuadro rojo) a las 2, 4, 6 y 8 horas post inmersión (hpi).

Para evaluar la respuesta inmune innata gatillada por las diferentes vacunas formuladas, se determinó la ubicación de los neutrófilos in vivo de larvas de pez cebra (Figura 1). Con el fin de cuantificar el número de neutrófilos movilizados, se seleccionó una región de interés (RDI) específica en la región dorsal de la cola, ya que en condiciones de homeostasis estas células se encuentran restringidas al tejido caudal hematopoyético (TCH). El análisis de la cuantificación de neutrófilos en el área indicada, mostró que sólo las formulaciones VAC y VAF LM-02-Fp fueron capaces de gatillar la respuesta del sistema inmune innato (Figuras 2C, 2D, 2K y 2L). El número de neutrófilos detectados fuera del TCH en las larvas tratadas con las formulaciones VAC o VAF LM-13-Fp, fue similar al del control negativo con el medio TYES (Figuras 2E-H, 2K y 2L). No se encontraron diferencias significativas al comparar el número de neutrófilos movilizados, entre las formulaciones de la misma cepa inactivadas por calor o por formaldehido (Figura 2K y 2L). La adición de un adyuvante a las formulaciones, mostró un aumento considerable de la respuesta inmune, inclusive en el grupo control TYES (Figura 2L y 2K). Este resultado indica que el adyuvante por sí mismo es capaz de gatillar la respuesta inmune innata.

Figura 2. Efecto de la respuesta inmune innata gatillada por vacunas recién preparadas contra F. psycrophilum. (A-L) Imagen representativa de colas de larvas de pez cebra a las 58hpf. (M-N) Representación gráfica de la cuantificación del número de neutrófilos presentes fuera del TCH (RDI), mostrando el efecto de la respuesta inmune innata tras la vacunación por inmersión con vacunas inactivadas por (M) calor o por (N) formaldehido. Los resultados fueron analizados a través de ANOVA de dos vías. (A-L) Todas las larvas fueron orientadas de anterior a la izquierda y dorsal en la parte superior. Los resultados representan el promedio ± error estándar, de tres experimentos independientes con 15 larvas cada uno. *p value < 0.05, *** < 0.001 y ****< 0.0001.
Figura 2. Efecto de la respuesta inmune innata gatillada por vacunas recién preparadas contra F. psycrophilum. (A-L) Imagen representativa de colas de larvas de pez cebra a las 58hpf. (M-N) Representación gráfica de la cuantificación del número de neutrófilos presentes fuera del TCH (RDI), mostrando el efecto de la respuesta inmune innata tras la vacunación por inmersión con vacunas inactivadas por (M) calor o por (N) formaldehido. Los resultados fueron analizados a través de ANOVA de dos vías. (A-L) Todas las larvas fueron orientadas de anterior a la izquierda y dorsal en la parte superior. Los resultados representan el promedio ± error estándar, de tres experimentos independientes con 15 larvas cada uno. *p value < 0.05, *** < 0.001 y ****< 0.0001.

Para determinar si el efecto de las formulaciones variaba a través del tiempo, el mismo ensayo descrito previamente se realizó utilizando formulaciones con un año de antigüedad. Los resultados indicaron que todas las vacunas redujeron su actividad (Figura 3). Para las vacunas VAC y VAF LM-02-Fp con adyuvante, la formulación fresca movilizó en promedio 11 neutrófilos a la RDI a las 8 horas post-incubación (hpi) (Figuras 2K y 2L), en contraste con las vacunas de un año de antigüedad, que sólo movilizaron 8 neutrófilos fuera del TCH después de 8 hpi (Figura 3). Asimismo, las vacunas de un año de antigüedad VAC y VAF LM-02-Fp sin adyuvante, disminuyeron su actividad en forma considerable. Más aún, la vacuna VAC LM-02-Fp sólo generó efecto a las 6hpi comparada con el control, mientras que VAC LM-02-Fp mostró efecto sólo a las 8 hpi (Figura 3).

Figura 3. Efecto de la respuesta inmune innata gatillada por vacunas con un año de almacenamiento preparadas contra F. psycrophilum. (A-B) Representación gráfica de la cuantificación de neutrófilos fuera del TCH (RDI), gatillada por la vacunación por inmersión con bacterinas inactivadas por calor (A) o por formaldehido (B). Los resultados se analizaron por ANOVA de dos vías. Los resultados representan el promedio ± error estándar, de tres experimentos independientes con 15 larvas cada uno. *p value < 0.05, **<0,005, *** <0.001 y ****< 0.0001.
Figura 3. Efecto de la respuesta inmune innata gatillada por vacunas con un año de almacenamiento preparadas contra F. psycrophilum. (A-B) Representación gráfica de la cuantificación de neutrófilos fuera del TCH (RDI), gatillada por la vacunación por inmersión con bacterinas inactivadas por calor (A) o por formaldehido (B). Los resultados se analizaron por ANOVA de dos vías. Los resultados representan el promedio ± error estándar, de tres experimentos independientes con 15 larvas cada uno. *p value < 0.05, **<0,005, *** <0.001 y ****< 0.0001.

 

Discusión

La vacunación es, actualmente, uno de los métodos más utilizados para la prevención de enfermedades en peces. Por lo tanto, es muy importante en la industria acuícola conocer la eficacia y eficiencia de las diferentes vacunas comerciales disponibles. Una etapa preliminar en la generación/selección de una vacuna contra un patógeno específico, debería ser determinar su efecto sobre el sistema inmune innato, dado que mientras mayor sea esta activación, mayor será la producción de anticuerpos específicos. En contraste, antígenos que no son capaces de inducir una respuesta de sistema inmune innata, inducirán una producción más pobre de anticuerpos.

En Chile, el uso de bacterinas generadas con cepas autóctonas y aplicadas por inmersión, se ha utilizado como método de protección contra F. psychrophilum durante años (Bravo y Midtlyng, 2007). Sin embargo, a la fecha aún existe poca información respecto de la efectividad de estos productos biológicos en términos de sobrevivencia relativa. Más aún, una vacuna comercial a nivel mundial desarrollada contra este patógeno sigue siendo un anhelo, lo que se refleja en la alta cantidad de estudios actualmente en desarrollo que buscan la generación de una vacuna comercial global (Gómez y col., 2014).

En la actualidad, no existen estudios comparativos en peces respecto de la respuesta desencadenada por antígenos inactivados por formaldehído o por calor; sólo están disponibles estudios que utilizan vacunas por inmersión en peces de la misma población. De hecho, no hay resultados concordantes en trabajos previos, realizados con diferentes vacunas que contienen células virulentas inactivadas por formaldehído o por calor de F. psychrophilum. Esta situación podría explicarse debido a que los experimentos se desarrollan en diferentes especies de peces: trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss), salmón Coho (Oncorhynchus kisutch) y ayu (Plecoglossus altivelis). Otra posible explicación a las diferencias observadas puede deberse a que la formulación de las vacunas utilizadas en esos estudios difieren en el contenido de adyuvante (Holt, 1987; Obach y Baudin Laurencin, 1991; Lorenzen 1994; Rahman y col., 2000; Rahman y col., 2002; 2003; LaFrentz y col., 2002). Madetoja y col. (2006) compararon la eficacia de antígenos inactivados tanto por formaldehído como por calor, en trucha arcoíris, usando un desafío con inyección intraperitoneal, demostrando que ambos antígenos son capaces de producir altos niveles de anticuerpos contra F. psychrophilum. En este sentido, nuestros resultados concuerdan con este estudio, dado que las formulaciones LM-02-Fp y LM-13-Fp, independiente del método de inactivación, gatillaron una respuesta inmune similar en pez cebra.

Sin embargo, el presente estudio utiliza un conjunto de vacunas suplementadas con Montanide IMS 1312 VG, adyuvante acuoso que contiene partículas de líquido y un compuesto inmunoestimulante, catalogado como una sustancia segura (GRAS, generally recognized as safe). Se ha demostrado que este adyuvante mejora la presentación del antígeno a las células inmunes, además se mantiene dentro de los tejidos de los peces, aumentando así la duración de la protección. Es importante destacar que no presenta efectos secundarios como melanosis (Hastein y col., 2005). En este sentido, este trabajo demuestra que Montanide IMS 1312 VG puede ser utilizado en estudios sobre la vacunación de peces contra F. psychrophilum. Además, este adyuvante es capaz de activar la respuesta inmune innata en pez cebra. Actualmente, nuevos estudios inmunológicos están en curso en trucha arcoíris, con el fin de establecer la respuesta inmune adaptativa a antígenos específicos gatillados por estas mismas vacunas (datos no publicados).

Otro factor que debiera estudiarse a fondo antes de diseñar una vacuna eficaz, es la serotipificación dentro de las especies bacterianas. Mata y col. (2002), propusieron un sistema de serotipificación de F. psychrophilum mediante la aglutinación de antígenos comparados con esquemas serológicos previamente propuestos (Lorenzen y Olesen, 1997; Izumi y Wakabayashi, 1999). Con este nuevo método se establecieron entre tres y siete serotipos, principalmente asociados con la especie hospedadora (Hastein y col., 2005). En Chile, Valdebenito y Avendaño-Herrera (2009) determinaron la existencia de heterogeneidad antigénica dentro de F. psychrophilum, con cuatro patrones de reacciones serológicas. Según este esquema serológico, LM-02-Fp corresponde al Grupo 1, mientras que la cepa LM-13-Fp pertenece al Grupo 4. Por lo tanto, una posible explicación para las diferencias en los resultados obtenidos para las vacunas LM-02-Fp y LM-13-Fp sobre la respuesta inmune innata en el pez cebra, puede explicarse por la presencia de diferentes grupos antigénicos. Así, con el fin de diseñar una vacuna eficiente y con amplio espectro, será necesario determinar diferencias en serotipos determinados y experimentos de protección cruzada.

En este trabajo, la nueva estrategia utilizada permitió realizar un análisis inicial, pero esencial, en la selección de una vacuna eficaz, esto es, la activación de mecanismos celulares que se proyecta promoverán la presentación antigénica y la consiguiente respuesta inmune adaptativa (Nathan, 2006). Los resultados mostraron que ambas vacunas con adyuvantes (cepa LM-02-Fp y LM-13- Fp) ejercieron efectos similares sobre la respuesta inmune innata, aunque la cepa LM-02-FP fue capaz de inducir la migración de neutrófilos sin la adición de adyuvante. Al respecto, se puede especular que las vacunas VAC/VAF LM-02-Fp podrían ser capaces de inducir la generación de anticuerpos específicos contra F. psychrophilum. Esto, en contraste con los efectos gatillados por las VAC/VAF LM-13- Fp, que produjeron una respuesta inmune no específica, dada principalmente por la presencia de adyuvante. Nuestros resultados sugieren que las vacunas VAC y VAF LM-02-Fp, serían mejores candidatas para una nueva formulación de vacunas.

Finalmente, el uso del pez cebra como modelo, permitirá profundizar nuestro conocimiento respecto de los mecanismos que controlan el sistema inmune adaptativo en peces. Actualmente, las vacunas para peces se desarrollan principalmente de acuerdo al conocimiento de inmunidad adaptativa de mamíferos, un escenario no ideal, dada las diferencias entre ambos sistemas inmunes adaptativos (Magnadóttir y col., 2001; Meeker y Trede, 2008; Magnadóttir y col., 2009; Uribe y col., 2011). Hoy en día, es ampliamente aceptado que los peces, incluido el pez cebra, comparten similitudes con el sistema inmune de mamíferos (Yoder y col., 2002; Van der Sar y col., 2004; Trede y col., 2004; Lin y col., 2006; Meeker y Trede, 2008). Por ejemplo, ambos sistemas están conformados por células inmunes comparables, como leucocitos y linfocitos (Lieschke et a., 2001; Wittamer y col., 2011; Page y col., 2013; Lewis y col., 2014; Zhang y Cui, 2014). Además, el sistema inmune adaptativo se vuelve funcional más tarde durante el desarrollo embrionario, posterior al desarrollo del sistema inmune innato (Lam y col., 2004).

Sin embargo, éste también presenta importantes diferencias con respecto al sistema inmune adaptativo de mamíferos, como por ejemplo, que en peces, la inmunoglobulina más abundante es IgM, mientras que en los mamíferos es la IgA (Uribe y col., 2011; Acton y col., 1971; Wilson y col., 1992). Es importante recordar que existen varios procesos inmunes que aún no se han descrito en peces, entre los que se encuentran la presentación antigénica y la existencia de células de memoria. En este sentido, las disponibilidad de líneas de pez cebra transgénicas que tienen marcadas las células inmunes con fluorescencia (Langenau y col., 2004; Renshaw y col., 2006; Hall y col., 2007; Bertrand y col., 2008; Wittamer y col., 2011; Page y col., 2013; Ellett y col., 2011;), hacen posible utilizar este pez teleósteo como un indicador de procesos inmunes in vivo.

 

Conclusión

Las vacunas VAC y VAF LM-02-Fp inducen una mayor respuesta inmune innata, que las demás formulaciones analizadas. Luego de un año de almacenamiento a 4 °C la capacidad de las vacunas formuladas de inducir la respuesta inmune innata se reduce considerablemente. Finalmente, la estrategia utilizada en este trabajo, con el pez cebra como modelo animal, es una aproximación metodológica que no sólo permite analizar los mecanismos que controlan la respuesta inmune innata de los peces, sino también las vías de infección bacteriana y la respuesta inmune adaptativa inducida por diferentes vacunas.

 

Referencias

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