Técnicas innovadoras para evaluación de la salud de la piel

La estructura de la piel de los peces está altamente adaptada al ambiente acuático. La piel y su capa de mucus asociada es la primera barrera de defensa del pez frente al ambiente y consiste en una capa mucosa externa de composición compleja, la epidermis y la dermis.

La epidermis consiste en un epitelio escamoso estratificado, no queratinizado de un grosor entre 3 a 20 capas de células (Ferguson 1989). La unidad básica es la célula epitelial (cel. de Malpighi o célula filamentosa), que es metabólicamente activa y capaz de dividirse a través de todas las capas, aunque mayormente en capas más profundas. Las células superficiales exhiben micro-crestas que probablemente sirven para retener el mucus. Las células epiteliales son capaces de migrar rápidamente y cubrir las úlceras después de un daño mecánico.

La epidermis también posee células mucosas (CM) las cuales son glándulas unicelulares más frecuentemente ubicadas en la capa media y externa (estrato superficial). En la superficie la CM se rompe en su ápice, se libera su contenido (mucus) y es exfoliada.

La dermis está dividida en 2 capas principales: estrato esponjoso y estrato compacto. El estrato esponjoso es una red laxa de tejido conectivo (fibroblastos, tej. Nervioso y células pigmentadas). El estrato compacto es una red densa consistente principalmente en bandas de colágeno ortogonal. El estrato compacto está limitado por una capa de células llamada el endotelio dermal que lo separa de la hipodermis que es una capa bien vascularizada de tejido conectivo laxo y adipocitos. Bajo la hipodermis se encuentra el músculo esquelético. La función de la dermis es de protección y biomecánica, ayudando a la tracción, locomoción y desplazamiento.

Las escamas cumplen una función protectora y se originan en los bolsillos de escama en la dermis. La escama consiste en una placa de tejido colágeno con mineralización superficial. Cada escama está anclada en los bolsillos por fibras colágenas y su parte posterior se proyecta hacia la epidermis y es cubierta por ésta (Imagen 1 y 2).

El mucus de la piel del pez es un material multifuncional que sirve en la respiración, regulación iónica y osmótica, reproducción, comunicación, excreción y resistencia a enfermedades. El mucus está formado principalmente por agua y mucina (proteínas altamente glicosiladas) y su función protectora es resultado de propiedades mecánicas y bioquímicas. Es secretado por las células mucosas en la epidermis y actúa como primera barrera de defensa (atrapa y exfolia patógenos). Dentro de los componentes inmunológicos del mucus se encuentran Lectinas, pentraxinas, lisozimas, enzimas proteolíticas, fosfatasa alcalina, proteína C reactiva, complemento, péptidos antimicrobianos, inmunoglobulinas. Estos componentes le dan a la piel la capacidad de combatir patógenos presentes en el medio.

Ha sido propuesto que el grosor de la capa de mucus está determinado por el balance entre la tasa de secreción y la tasa de degradación. Sustancias tóxicas e irritantes pueden estimular la secreción de mucus, así como también la presencia de estresores y patógenos. Hay evidencia que la composición del mucus cambia con la temporada del año, smoltificación, salinidad, stress, enfermedades.

Alteraciones de la piel

Existen múltiples factores estresantes tanto mecánicos como ambientales que tienen impacto en la condición de la piel. La piel dañada es un portal de entrada para patógenos primarios y secundarios. Dos de los principales problemas de la industria están relacionados a la salud de piel: Sea lice y úlceras de origen diverso (mecánico, temperaturas extremas, patógenos).

Muchos factores pueden afectar la salud de la piel como calidad de agua (T°, O2, salinidad), manejos (graduaciones, transporte, cambio de mallas, tratamientos, cosecha) y estrés, el cual causa liberación de factores inmunes innatos (Imagen 3).

Dentro de los factores físicos que afectan la piel se encuentran: ejercicio, presión, desgarros, canibalismo por disponibilidad de alimento, químicos resultantes de cambios en pH, O2, CO₂ y xenobióticos (Davis 2010). Estos factores pueden alterar la estructura de la epidermis y la densidad de células mucosas.

Dentro de los patógenos infecciosos de mayor relevancia en la salud de la piel se encuentran: Flavobacterium sp., Tenacibaculum sp., Vibrio sp., ICH, Sea lice, Piscirickettsia salmonis y Aeromonas salmonicida (Imagen 4).

Algunos componentes nutricionales son esenciales para una piel saludable (proteínas, aminoácidos, ácidos grasos esenciales, vitaminas y minerales). La vitamina C juega un rol importante como un agente reductor, formación de colágeno y reparación de úlceras, resistencia a patógenos y estimulante del complemento, lisozimas, proliferación de células inmunológicas y producción de anticuerpos. La deficiencia de Vitamina A y B puede causar oscurecimiento de la piel. El zinc ha mostrado efectos benéficos en reparación de úlceras, modulando la inflamación, apurando el proceso de re-epitelización, estimulando la proliferación de fibroblastos y la síntesis de colágeno. El fósforo (P) y calcio (Ca) son esenciales para la formación y reparación de escamas y reparación de úlceras. Otros componentes nutricionales de importancia como glucanos, nucleótidos y extractos vegetales han mostrado efectos benéficos en la piel.

Dietas funcionales (antioxidantes, vitaminas, inmunoestimulantes, ácidos orgánicos y extractos vegetales) pueden tener un efecto sistémico en funciones inmunológicas y también en los integumentos, fortaleciendo la piel y su capa mucosa.

Factores que influyen en componentes de la piel y su reparación

Jensen y col. (2014) encontraron un menor grosor de la epidermis y una mayor área de células mucosas en S. salar post-smolt sometidos a temperaturas de 16ºC comparados con los grupos sometidos a temperaturas de 4ºC en el agua.

O`Byrne-Ring y col, (2003) encontraron que el número de células mucosas en epidermis fue disminuyendo a medida que los peces iban avanzando en el proceso de esmoltificación (S. salar).

Se propone que a bajas temperaturas (menor a 4°C) se produce un mecanismo no específico de defensa que tiende a inmunosuprimir (Le Morvan y col. 1998).

Jensen y col. (2015) encontraron una mayor rapidez en la reparación de úlceras en peces mantenidos a 12ºC en el agua que aquellos mantenidos a 4ªC, también encontraron que dietas suplementadas con Zn tuvieron significativamente mayor área de epidermis cubierta con células mucosas en capas profundas (representando un más avanzado progreso en la reparación).

Sveen y col. (2019) infringieron úlceras de forma experimental en salmones Atlántico mantenidos a 10ºC. En la evaluación histológica de la evolución de las lesiones encontraron una fase temprana de curación en donde se produce hemostasis, reparación epidermal, fuerte inflamación y degradación del tejido. A los 14 días post ulceración se observó un punto de transición en donde se activa la inflamación y el proceso de regeneración del tejido (inmunidad innata/ degradación del tejido y comienzo de la respuesta humoral) también se produce regeneración del tejido fibroso (formación de escamas, deposición de colágeno y formación de tejido de granulación). A los 14 - 36 días post-ulceración la úlcera comienza a contraerse. Luego a los 36 días post ulceración el tejido de granulación llena la cama de la úlcera y células pigmentadas migran dentro del tejido fibrótico. Finalmente a los 43 - 57 días post-ulceración el tejido de granulación regresa y la úlcera se aproxima al fenotipo de piel normal (Imagen 5).

Técnicas diagnósticas

VEHICE cuenta con un amplio portafolio de técnicas para la evaluación de la integridad y la salud de la piel, dentro de éstas se encuentran técnicas histológicas genéricas, como la tinción H&E, que evalúa la arquitectura de los tejidos y técnicas histológicas específicas, como la tinción Tricrómico de Masson, que evalúa el tejido colágeno (de relevancia para evaluar integridad de dermis).

Nuestro laboratorio también ofrece las tinciones Von Kossa y Rojo alizarín que evalúan la mineralización de las escamas (deficiencia de minerales), la técnica Rojo Junqueira que cuantifica la proporción de los tipos de colágeno (evaluación de madurez y desarrollo de los tejidos) y la tinción PAS - azul alcián que identifica las células mucosas y sus características (evaluación de salud de la piel).

Además de esto VEHICE ha desarrollado la técnica HISTO_SCALE, que analiza la escama, la cual es una estructura que actúa como indicador prematuro de patologías en piel y procesos de desmineralización, pudiendo ser un indicador relevante respecto a la historia nutricional, fisiológica y patológica del pez. Otra innovadora técnica desarrollada por VEHICE es la técnica cuantitativa DATA_SKIN, con la que, mediante el uso de inteligencia artificial, se cuantifican parámetros relacionados a la integridad y funcionalidad de la piel, pudiendo medir y cuantificar distintos tipos de células mucosas, grosor de epidermis y sacar ratios estadísticos relevantes respecto a la estructura de epidermis.

Como complemento diagnóstico, VEHICE cuenta con técnicas validadas de inmunohistoquímica para la detección de los patógenos que afectan la salud de piel asociados a las lesiones que estos generan a nivel histológico, pudiendo observar las alteraciones, la ubicación y cantidad de estos agentes patógenos.

Todas estas técnicas son de gran utilidad para para evaluar alteraciones y patologías de la piel, así como también para realizar seguimiento y monitoreo de la salud de este tejido en pruebas de campo o en condiciones controladas (dietas funcionales, tratamientos, estresores ambientales, etc.) (Imagen 7).

Referencias

Elliot, T., J.M. & Elliott, J.A. (2010). Temperature requirements of Atlantic salmon Salmo salar, brown trout Salmo trutta and Arctic charr Salvelinus alpinus: predicting the effects of climate change. J. Fish Biol., 77, 1793-1817.

Jensen L. (2015). Nutritional and environmental impacts on skin and mucus condition in Atlantic salmon (Salmo salar L.). Dissertation for the degree of philosophiae doctor (PhD) at the University of Bergen.

Jensen L., Sebastian Boltana, Alex Obach, Charles McGurk, Rune Waagbø and Simon MacKenzie (2014). Investigating the underlying mechanisms of temperature related skin diseases in Atlantic salmon, Salmo salar L.: as measured by quantitative histology, skin transcriptomics and composition. Journal of Fish Diseases. Doi: 10.111/jfd.12314

Jensen L., Thomas Wahli, Charles McGurk, Tommy Berger Eriksen, Alex Obach, Rune Waagbø, Ana Handler, Carolina Tafalla (2015). Effect of temperature and diet on wound healing in Atlantic salmon (Salmo salar L.). Submitted to “Fish Physiology and Biochemistry”.

O´Bryne-Ring N., Dowling K., Cotters D., Whelan K., MacEvilly U. (2003). Changes in mucus cell numbers in the epidermis of the Atlantic salmon at the onset of smoltification. Journal of Fish Biology 63, 1625–1630.

Sveen L., Karlsen C., Ytteborg E. 2020. Mechanical induced wounds in fish – a review on models and healing mechanisms. Reviews in Aquaculture 12, 2446–2465.