Estudian Piscirickettsia con herramientas de silenciamiento genético: prometedores resultados
Mediante la herramienta Mobile-CRISPRi, científicos chilenos lograron silenciar genes en Piscirickettsia salmonis, abriendo nuevas vías para el estudio de su patogénesis.
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El sistema CRISPR-Cas es una herramienta ampliamente utilizada en ingeniería genómica. Una de sus variantes, la interferencia CRISPR (CRISPRi), emplea una Cas9 inactiva (dCas9) que, guiada por un sgRNA, permite silenciar o "apagar" la expresión de genes específicos sin cortar el ADN.
Más recientemente, se desarrolló Mobile-CRISPRi, un sistema basado en vectores modulares que permite silenciar genes en bacterias. Esta estrategia amplía el estudio de la función génica a especies y cepas no modelo.
En un nuevo estudio realizado por científicos de la Universidad de Chile, se investigó la implementación de un sistema Mobile-CRISPRi para generar silenciamiento génico en Piscirickettsia salmonis.
Lo anterior, utilizando una proteína dCas9 catalíticamente inactiva y un ARN guía único (sgRNA) inducible por isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG).
“Demostramos la eficacia del sistema CRISPRi en P. salmonis mediante el silenciamiento de un reportero exógeno (sfGFP) y un regulador endógeno (Fur) que controla la homeostasis intracelular del hierro en bacterias”, explicaron los expertos respecto de la técnica.
Así, la expresión inducible de dCas9 y el sgRNA dirigido por sfGFP causó una disminución del 98,7% en la fluorescencia en la cepa knockdown. Este sistema de silenciamiento fue efectivo en siete cepas de P. salmonis de ambos genogrupos.
Además, los investigadores también utilizaron el mismo sistema para construir cepas knockdown fur, lo cual produjo una disminución de 50 veces en el nivel de expresión del gen cuando se indujo la expresión del ARNg fur con IPTG.
Por otro lado, mediante RNA-seq, los autores detectaron un aumento significativo en la expresión de genes que codifican los sistemas de adquisición de Fe2 + y Fe3 + y la movilización de hierro en la inhibición de fur1 después de la inducción de IPTG. Todos los genes con una expresión aumentada más del doble en el RNA-seq presentaron la secuencia consenso Fur box en su región reguladora.
Con todo lo anterior, los científicos señalaron que la implementación del sistema Mobile-CRISPRi en P. salmonis “ha demostrado ser efectiva, proporcionando así una herramienta con potencial aplicación para el análisis de la función génica en este patógeno. Se anticipa que estos análisis serán valiosos para identificar genes involucrados en los mecanismos de patogénesis de P. salmonis”.
Lea el estudio completo titulado "Mobile-CRISPRi as a tool for genetic manipulation in the intracellular pathogen Piscirickettsia salmonis", aquí.
