ANALISIS GENoMICo DE CEPAS DE Piscirickettsia salmonis PRESENTES EN CHILE
1,3Isla A., 1Haussmann D., 1,3Lagos F., 1,3Cartes. C, 1,3Vera T., 1,3Yañez A., 2,3Romero A.,1,3Figueroa J. E-mail Figueroa J.: jefigueroa@uach.cl
1Instituto de Bioquímica y Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile, Valdivia. 2Instituto de Patología Animal, Laboratorio de Biotecnología Acuática, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile, Valdivia. 3Centro FONDAP: Interdisciplinary Center for Aquaculture Research (INCAR) Proyecto FONDAP N° 15110027
RESUMEN
En la salmonicultura nacional, del total de pérdidas producidas durante el ciclo de producción, al menos un 40% corres- ponde a enfermedades infecto-contagiosas. Una vez presentados los brotes de una enfermedad, principalmente causados por bacterias, la única forma de controlar la mortalidad es a través de la utilización de antibióticos. La prevención ha sido hasta ahora la mejor manera de reducir el impacto económico que producen este tipo de enfermedades. Sin embargo, actual- mente es difícil comprender si los patógenos de peces aislados en Chile difieren en sus características microbiológicas, bioquímicas, serológicas y moleculares respecto de aislados del extranjero. En este contexto aparece el patógeno Piscirickettsia salmonis, bacteria intracelular facultativa que fue observada en Chile por primera vez en 1989 y agente causal de SRS (Síndrome Ricketsial del Salmón). Se identificaron zonas geográficas y, por cada zona, se realizaron muestreos para aislar las cepas patógenas de P. salmonis a partir de centros de cultivo. Se realizó confirmación anatomo-patológica seguida de caracterización fenotípica, la que incluyó la caracterización morfológica, bioquímica y serológica de 47 cepas. De cada inoculo puro se realizó caracterización molecular (PCR del gen ribosomal 16S y del es- paciador intergénico 16S-23S [ITS]). Las secuencias se compararon con software de análisis (Clustal W, PhyML, MUSCLE y TreeDyn) para determinar homología de secuencias y análisis génico comparativo. Finalmente, se logró secuenciar los genomas de 9 cepas del patógeno, perte- necientes a los 4 genogrupos en que se distribuyen las cepas nacionales. Los genomas muestran características claras que permiten clasificar a P. salmonis como una bacteria intracelular facultativa. Adicionalmente, se logró definir cerca de 3.500 regiones codificantes correspondientes a genes de diver- sas categorías de funciones.
INTRODUCCIÓN
Durante su desarrollo, la industria acuí- cola, especialmente de salmónidos, ha lo- grado posicionarse como el cuarto sector exportador del país. No obstante, una de las mayores amenazas a la salmonicultura nacional e internacional son las pérdidas producidas durante el ciclo de producción por enfermedades infecto-contagiosas. Pre- vio y posterior a la aparición de virus ISA, la enfermedad más perjudicial que afecta al cultivo del salmón en Chile, por el nivel de pérdidas producidas, es el Síndrome Ric- kettsial del Salmón (SRS), causado por la bacteria intracelular Piscirickettsia salmonis. Esta patología afecta a las especies de salmones en cultivo masivo, siendo la más susceptible el salmón del Pacifico, la tru- cha y el salmón del Atlántico. Por lo tanto, hemos generado la primera base de datos acerca de las diferentes cepas de P. salmonis presentes en Chile, para poder generar las herramientas biotecnológicas efectivas que permitan disminuir considerablemente los efectos de este patógeno.Desde el punto de vista terapéutico, el SRS que aflige la acuicultura global de salmones, responde mal al tratamiento de antibióticos, probablemente, por seruna bacteria con capacidad de sobrevivir intracelularmente en los hospederos que infecta.
RESULTADOS Y DISCUSION
Análisis Genómico: Hasta el momento y luego de más de 4 años de trabajo, se han aislado más de 47 cepas desde distin- tos orígenes geográficos, cuerpos de agua y diferentes hospederos (Yañez et al., 2012; Vera et al., 2012). Una actividad central de este trabajo ha sido la genotipificación de las distintas cepas de P. salmonis basado en las secuencias del 16S ribosomal (cerca de 1500 pb) y del espaciador intergénico 16S-23S (ITS) cerca de 500 pb. Hasta ahora, se han secuenciado los genes ribosomales 16S e ITS de todas las cepas y se han establecido análisis com- parativos de alineamiento múltiple de secuencias, por el programa Clustal W (Thompson et al., 1994). A partir de éstos, se ha generado filogenia en base a máxima probabilidad (Chavenet et al., 2006; Elias et al., 2007; Dereeper et al., 2008). El análisis de secuencias del 16S ribosomal mostró la conformación de 2 genogrupos, absolutamente independientes con 5 subgrupos, lo cual es relativamente esperado, dado que este gen es muy conservado entre miembros de una misma especie y, en el caso particular de bacterias, la conserva- ción evolutiva se ve incrementada. Por esta razón se analizó también el espaciador intergénico 16S-23S (ITS). Se analizaron secuencias de las cepas aisladas, utilizando las mismas herramientas bioinformáticas utilizadas para analizar el 16S ribosomal (War- sen et al., 2004). Para la confección de los arboles filogenéticos se agregaron al listado de secuencias, las depositadas en bancos de datos de DNA internacionales del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Los arboles filogenéticos, de máxima probabi-
lidad arrojaron como resultado la forma- ción de 10 genogrupos filogenéticamente independientes perfectamente aislados. Las cepas aisladas se distribuyen exclusi- vamente en 4 de estos grupos. Existen 22 cepas chilenas que tienen alta homología con las cepas AL10015 y EM-90, mientras que 14 cepas muestran similitud con la cepa LF-89. Mientras 2 cepas nacionales son independientes y forman grupos génicos únicos (Tabla 1). Por su parte, el resto de las cepas europeas y norteamericanas se distribuyen en grupos independientes.
Análisis de los Genomas:
Con el objetivo de describir en mayor detalle el microorganismo Piscirickettsia salmonis, se realizó la secuenciación masiva del genoma del patógeno. Para ello se utilizó el secuenciador masivo Genome Sequencer FLX Titanium (Roche), mediante la estrate- gia de shotgun para 9 genomas con librerías tipo MID. Las lecturas obtenidas durante la se- cuenciación masiva fueron ensambladas denovo utilizando el software Celera As- sembler (Celera Genomics). Posteriormente, se analizó la calidad de los ensamblajes y se generó las primeras hipótesis de los geno- mas (Tabla 2). Luego del análisis sobre la calidad de los ensamblajes generados por la aplica- ción, se realizó la anotación automática de los ensamblajes utilizando el servidor online RAST (Rapid Annotation using Subsystem Techology). Este análisis permitió identificar in silico las secuencias codificantes y asignar una función a cada gen identificado. Los resultados indican que el genoma de P. salmonis posee un porcentaje de G/C cercano al 39% y respecto a las secuencias codificantes, un 50% de los genes identi- ficados corresponden a los subsistemas re- lacionados con la pared celular y cápsula; cofactores, grupos prostéticos, pigmentos, vitaminas; el metabolismo de las proteínas, carbohidratos, RNA y genes misceláneos (Figura 1). La anotación automática del ensamblaje de novo del genoma de P. salmonis permitió identificar in silico un promedio de cerca de 3.600 secuencias codificantes (CDS). Los resultados bioinformáticos del análisis del genoma de Piscirickettsia salmonis permitió clasificarla como un microorganismos con asociación facultativa a un huésped (intra- celular facultativo), ya que los resultados obtenidos concuerdan con los antecedentes reportados por Marhej et al. (2009). Los resultados bioinformáticos derivados del análisis del genoma confirman la des-
Tabla 2: Genomas secuenciados de las 9 cepas nacio- nales en que se destaca el tamaño de los mismos en N° de pares de bases y los genes predichos en cada uno de ellos.
Análisis de los Genomas:
Con el objetivo de describir en mayor detalle el microorganismo Piscirickettsia salmonis, se realizó la secuenciación masiva del genoma del patógeno. Para ello se utilizó el secuenciador masivo Genome Sequencer FLX Titanium (Roche), mediante la estrate- gia de shotgun para 9 genomas con librerías tipo MID. Las lecturas obtenidas durante la secuenciación masiva fueron ensambladas denovo utilizando el software Celera Assembler (Celera Genomics). Posteriormente, se analizó la calidad de los ensamblajes y se generó las primeras hipótesis de los geno- mas (Tabla 2). Luego del análisis sobre la calidad de los ensamblajes generados por la aplicación, se realizó la anotación automática de los ensamblajes utilizando el servidor online RAST (Rapid Annotation using Subsystem Techology). Este análisis permitió identificar in silico las secuencias codificantes y asig cripción fisiológica realizada por Mauel et al., 2008 y Mikalsen et al., 2007, quienes previamente habían clasificado a P. salmonis como un patógeno intracelular facultativo, por su capacidad de crecer en medio artificiales suplementados con sangre de peces o mamíferos.
CONCLUSIONES
Del análisis genómico de las secuencias del gen 16S ribosomal se logró determinar que todos los aislados se distribuyen en al menos 2 genogrupos con 5 subgrupos diferentes e independientes. El análisis de secuencia del espaciador intergénico (ITS) arroja que todos los aislados tanto nacionales como los disponibles en genebank, determinan la existencia de al menos 10 grandes grupos, mostrando que los aislados (cepas) chilenas se distribuyen exclusivamente en 4 de estos grupos. Sólo 2 aislados mostraron secuencias de tRNA al interior del ITS. El análisis de los genomas muestra claramente que P. salmonis puede ser nítidamente clasificada como una bacteria intracelular facultativa, con cerca de 3.500 genes pre- dichos, de los cuales un porcentaje impor- tante son genes de función desconocida.
REFERENCIAS
Casanova A., Obreque J., Sandino A. and Jashe M. 2001 tRNA genes were found in Piscirickettsia salmonis 16S-23S rDNA spacer region (ITS). FEMS Microbiology Letters 197:
19-22.
