Primeros avances en Caligidosis Aplicación de herramientas genómicas y estudios de transcriptómica

Sissel Kjoglum Ph.D en bioestadística Investigadora en genética AquaGen Chile.

Gabriela Schroeder B. Ingeniera en Acuicultura. Jefa de Investigación y Desarrollo AquaGen Chile. 

Daniela Cichero M. Médico Veterinario Asistente de Investigación AquaGen Chile. 

Dr. Victor Martinez. DVM MSc. PhD DIRECTOR. Laboratorio FAVET-INBIOGEN Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias. UNIVERSIDAD DE CHILE.  Karen Neumann.  Lic Biol. DVM Dr.(c) Laboratorio FAVET-INBIOGEN Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias. UNIVERSIDAD DE CHILE.

Introducción

Sabido es que un factor de inestabilidad de la industria es la infestación por el pa- rásito Caligus (Caligus rogercresseyi), especie endémica de los mares de Chile y que sólo se encuentra presente en la industria salmonicultora chilena. Este ectoparásito afecta principalmente a salmón del Atlántico y trucha, que representan hoy en día más del 80% de la producción total de salmones en nuestro país. El Caligus precedió la crisis sanitaria del año 2007 en Chile y existe evidencia de que la alta infestación por Caligus generó un estrés crónico en los peces, inmuno-de- primiéndolos y  permitiendo entonces  la explosión de la infección por el virus ISA.

Los niveles de Caligus de la industria en el tiempo se muestran en el gráfico si- guiente.(Fig.1) La evolución de la infestación de Caligus mejoró significativamente entre los años 2009 y 2010, sin embargo, junto con el repunte en biomasa de la industria el año 2011 y, en especial, durante el 2012, la infestación de Caligus ha ido incrementándose a partir de la mitad del año 2011, llegando a niveles críticos en ciertas zonas, en especial en la Región de Aysén, lo que se puede observar en el gráfico siguiente. (Fig.2) El impacto económico directo por Caligus se estima en la actualidad en US$ 150 millones para el año 2013, considerando que sólo por concepto de aplicación de fármacos la industria gasta alrededor de US$30 millones al año; además, se estima que otros US$ 100 millones se pierden por costos asociados al deterioro productivo de las poblaciones infectadas por Caligus.

Las drogas disponibles para controlar Caligus son muy limitadas y las prácticas implementadas son aún insuficientes. Esto lleva a la necesidad de buscar soluciones en otras áreas de las ciencias. La experiencia de Aquagen Chile en la implementación de Selección Genómica impulsó la Conformación de un Consor- cio enfocado en la aplicación de técnicas de genómica de última generación para la obtención de productos que contribuyan sustancialmente a la sustentabilidad de la industria salmonicultora. El mencionado Consorcio prioriza en el corto y mediano plazo la investigación relacionada con las dos principales enfer- medades que hoy afectan negativamente a la industria: Piscirickettsiosis y Caligidosis. Con los resultados del proyecto antes mencionado, que culmina en diciembre de este año, se validarán productos relacionados con Pisciricketsia salmonis en Salmo salar y se extenderán las investigaciones a Trucha. En el caso del Caligus, se comienza desde el nivel basal con la ejecución de un desafío experimental con el cual se obtuvo información basal para la implementación de Estudios de Asociación Amplia que nos permitan identificar marcadores relaciona- dos con la resistencia a Caligus y generar productos con altos niveles de resistencia al parásito. Por otra parte, conocer la interacción entre el parásito y el hospedero, permitirá un manejo más preciso de la infestación. El entendimiento de esta interacción requiere conocer los genes que se expresan durante ésta. A la fecha, no se han realizado estudios de expresión de genes en salmónidos con Caligus rogercresseyi, por lo que el objetivo del desafío es determinar la respuesta transcriptómica del salmón del Atlántico (Salmo salar), especie salmónida que ha demostrado ser la mas susceptible al piojo y la mayormente cultivada en Chile (Gonzalez et al., 2000; Bravo, 2003; Pino-Marambio et al., 2007; Sernapesca, 2013) a los distintos estadios de desarrollo sésil del piojo de mar C. rogercresseyi, además, entender con mayor profundidad los mecanismos genéticos que explican las razones por las cuales algunos peces son más resistentes a caligus. Uno de los objetivos de Blue Genomic Chile es, entonces, abordar la interacción que existe entre el piojo y sus hospederos más susceptibles. El mismo ensayo, diseñado para identificar resistencia y susceptibilidad en la población de Aquagen Chile, se utilizó para obtener las muestras necesarias para el estudio de esos genes.

Metodología Un estudio de asociación a través de todo el genoma (GWAS) consta de 4 fases: (1) Obtención de Fenotipos o rasgos medidos en una población, para seleccionar casos y controles de un gran número de individuos que hayan sido expuestos a la enfermedad o medidos para el rasgo de interés (SRS y Caligus). (2) Genotipificación de casos y controles mediante arreglos o chips de alta densidad y análisis de datos para garantizar una alta calidad del genotipado de cada individuo. (3) Estudio de asociación considerando pruebas estadísticas, para las asociaciones entre los polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) que pasan umbrales de calidad y los casos y controles mediante algoritmos especializados. (4) Validación de la asociación: La replicación de las asociaciones identificadas en una muestra de población independiente o en el examen de las implicaciones funcionales de forma experimental. Después de realizar los desafíos, los datos de mortalidad se analizan y se calculan los parámetros genéticos. Los individuos más relevantes son seleccionados para el aislamiento de ADN y genotipado con los chips de SNP de alta densidad. Los datos se utilizan en estudios de asociación genómica, en la que los cientos de miles de SNP a lo largo de todo del genoma se someten a prueba para medir la asociación con fenotipos de resistencia a la enfermedad en un número significativo (cientos o miles) de peces. Una revisión posterior de los datos, permite cuantificar la importancia relativa de cada SNP o bien de bloques haplotípicos, calculando la varianza asociada a cada SNP. Con esta información es posible determinar si la selección asistida por marcadores se puede realizar mediante el uso de un número reducido de marcadores o bien es necesario utilizar selección genómica. Alguna secuenciación adicional en áreas de interés puede ser necesaria para buscar polimorfismos responsables que pudieran no detectarse al analizar sólo con SNP (delaciones, inserciones, secuencias invertidas). A la fecha, el Consorcio ejecutó dos desafíos a Caligus en Salmo salar, de manera sucesiva. El primero buscó identificar familias más resistentes y más susceptibles a la vez que obtener muestras para el Estudios de Transcriptómica que lidera el Dr. Víctor Martínez de la Universidad de Chile. En el segundo caso, el objetivo fue validar los resultados del primero.

La línea del tiempo en ambos casos se grafica de la siguiente manera: Para la ejecución de los desafíos, en ambos casos se utilizaron 119 familias pertencientes al programa genético de Aquagen Chile. Se seleccionaron dos mil trescientos sesenta y seis (2.366) ejemplares de Salmo salar, individualmente pesados y marcados por personal de Aquagen Chile S.A (promedio de 100-130 g aprox.), para su posterior traslado desde el centro de reproducción y genética (CRG) Comau a la estación experimental Quillaipe (Aquadvice) Una vez realizada la selección de los peces, los ejemplares fueron mantenidos, hasta el día de su traslado, en un solo estanque de manera de entregar exactamente las mismas condiciones a la totalidad de las familias y tener entonces resultados más fidedignos para compararlas. Los copepoditos utilizados para la infestación fueron producidos por Aquadvise

a partir de hembras colectadas de centros productivos. Antes de esto, se realizó un chequeo sanitario a los Caligus de manera de evitar infestaciones secundarias no deseadas. Durante el curso del primer desafío, se tomaron muestras a diferentes tiempos y de acuerdo al estadio de desarrollo del piojo (copepodito a chalimus I – IV), además de muestras previas al desafío. Al final del experimento, cuando los piojos se encontraban en el estadio de desarrollo sésil chalimus III – IV, se realizó un análisis de variación genética. El fenotipo se analizó con el fin de evaluar las familias que muestran fenotipos extremos y heredabilidad en el número de chalimus sésiles, de manera tal de entender con mayor profundidad los mecanismos genéticos que explican las razones por las cuales algunos peces son más resistentes a caligus. Se utilizó el promedio de piojos por familia para clasificarlas, luego de lo cual se seleccionaron 10 familias de cada extremo. Luego de este análisis inicial, se obtuvieron muestras de tejido desde ejemplares de cada familia seleccionada. Las muestras serán analizadas en grupos según tejido/tiempo. La preparación de la librería será realizada siguiendo el protocolo estándar de TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit (Illumina) utilizando los grupos de ARN total/tejido. La librería de ADNc será secuenciada utilizando la plataforma MiSeq (Illumina) en el laboratorio FAVET-Inbiogen de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile. 

Resultados a la fecha

Identificación de familias resistentes y suscpetibles. Los porcentajes de infestación obtenidos en ambos desafíos superaron el 85%, lo cual cumple más allá del objetivo planteado (75%).

Conclusiones

Los resultados preliminares del estudio de heredabilidad muestran resultados muy promisorios. También indican que la he- redabilidad calculada en base al número de Caligus es mayor a la resultante considerando la densidad. Esto indica una relación con el tamaño del pez, observando una mayor influencia en el caso de los peces más pequeños. Por otra parte, los resultados del segundo desafío validaron la selección realizada con los datos del primero, de las familias más resistentes y más susceptibles. Los cálculos de heredabilidad preliminares también arrojan resultados que validan la primera experiencia. Los datos obtenidos en este desafío y el segundo están aún en etapa de procesamiento y análisis. Estos datos preliminares generan importantes expectativas en que la resistencia a caligus sí pueda explicarse a través de la genética. Esto abre la posibilidad de seleccionar peces más resistentes a través de marcadores, lo cual tendrá seguramente un impacto realmente significativo en la sustentabili- dad de la industria salmonicultora en Chile.

Las muestras obtenidas para el Estudio de trascriptómica fueron ya derivadas al laboratorio FAVET-Inbiogen. Se esperan resultados preliminares durante el primer semestre del 2014. Los resultados de esta investigación de alto nivel permitirán avanzar en el entendimiento de la interacción entre el cáligus y Salmo salar desde el punto de vista de las moléculas involucradas, permitiendo buscar marcadores moleculares con aplicación directa y beneficio a la industria, mejorando el sistema productivo de forma económicamente eficiente y limpia.