Principales procedimientos de muestreo y análisis Métodos de diagnóstico del ISAv en Chile

Por Patricio Feest F. patricio@salmonexpert.cl

La infección por virus de la Anemia Infecciosa del Salmón (ISAv, por sus siglas en inglés) fue detectada por primera vez en Chile el 25 de julio del 2007, en un centro de cultivo en Chiloé central. A partir de ese momento, se ha detectado la enfermedad y el virus en otros centros de cultivos de salmón Atlántico, ubicados en distintas zonas de las regiones de Los Lagos, Aysén y Magallanes. El virus puede ser detectado en tejidos de peces mediante la técnica de biología molecular denominada Reacción en Cadena de la Polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction) o también llamado PCR cuantitativo (qPCR), a través de microscopia electrónica, inmunofluorescencia y cultivo en líneas celulares. Según diversos estudios comparativos acerca de los mejores métodos diagnósticos, PCR de transcripción inversa (RT-PCR por sus siglas en inglés) es la herramienta más sensible para la detección del virus ISA (Snow y Col., 2003 ). Considerando lo anterior, entre las principales estrategias de control del virus ISA por parte del Servicio Nacional de Pesca y Acuicultura (Sernapesca), se encuentra el establecimiento de laboratorios de referencia nacional y de diagnóstico acreditados por la Autoridad, con el fin de mejorar las medidas de vigilancia y de control de enfermedades, para lograr un rápido y eficaz diagnóstico de la infección.

Laboratorio de referencia Estos centros de investigación son designados por el Sernapesca para levantar información científica acerca de las principales enfermedades que afectan a la industria del salmón y sobre las cuales hay programas de vigilancia oficiales o medidas de control, en concordancia con las directrices de la Organización Mundial de Salud Animal (OIE), que recomienda mantener laboratorios de referencia para el correcto monitoreo y control de las enfermedades de los animales de cultivo. En Chile, el único laboratorio de referencia para ISAv es el Laboratorio de Patógenos Acuícolas de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso (PUCV), dirigido por el Dr. Sergio Marshall. En relación con el protocolo de análisis de muestras para el diagnóstico del ISAv que utiliza el Laboratorio de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, actual laboratorio de referencia de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE, por sus siglas en inglés) para ISAv, el investigador del Laboratorio, M.V. Álvaro Labra, detalló que éste considera dos etapas principales: Diagnóstico: el cual tiene por finalidad, por una parte comprobar mediante el análisis del factor de elongación 1 alfa (ELF-1α) el estado de degradación del material genético de la muestra, y por otro lado, comprobar la presencia de material genético del ISAv utilizando para ello dos ensayos de Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real con transcripción reversa (qRT-PCR), altamente sensibles y específicos dirigidos al segmento 8 del virus (Snow, 20062 y GIM). Caracterización: Una vez comprobada la presencia del ISAv se procede a caracterizar el virus, utilizando para ello cuatro herramientas: 1. qRT-PCR específico para HPR0: Este ensayo arroja resultados positivos sólo cuando la muestra ensayada es HPR0, por lo tanto, se intuye que siendo la muestra positiva a ISAv y negativa a este ensayo, se trata de un virus delecionado u “otros HPR”. 2. Producción especifica de DNA: Esta etapa sintetiza específicamente DNA a partir del molde específico de RNA viral (segmento 5 y 6). 3. Análisis complementarios: se utilizan dos ensayos desarrollados y validados por nuestro laboratorio HRM y DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis)(Carmona, 2012 y Sepúlveda, 2012) que nos permiten hacer un análisis más fino de la composición de las muestras, detectando de esta manera variantes de la secuencia. 4. Secuenciación y Análisis bioinformático: Finalmente, se realiza un análisis de la secuencia nucleotídica y/o aminoacídica deducida de cada una de las muestras, con lo cual comprobamos incuestionablemente los resultados obtenidos en el procedimiento.

Laboratorios de la Red de Sernapesca En tanto, los análisis de diagnóstico del ISAv sólo podrán ser realizados por laboratorios registrados por Sernapesca. Los procedimientos de muestreo y análisis para el presente programa se encuentran establecidos en las normas técnicas LABD/NT 1 y LABD/NT 2, respectivamente. De acuerdo al D.S. (Minecon) N° 15 del año 2011, Sernapesca mantiene una nomina de laboratorios de diagnóstico de enfermedades de especies hidrobiológicas, los cuales se conocen como laboratorios de la red del Servicio (Tabla 1).

Métodos de detección e identificación del ISAv La Jefa del Departamento de Salud Animal de Sernapesca, Marcela Lara, precisó que el método oficial en Chile, determinado por el Servicio Nacional de Pesca y Acuicultura, en adelante el Servicio, y recomendado por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), es el método desarrollado, publicado y validado por Michael Snow en el año 2006. Ante la detección de un resultado positivo al RT-PCR, se debe realizar la secuenciación de las muestras, para determinar la variante del virus presente. La introducción de las técnicas de biología molecular en Chile, el año 1994, marcó un punto de inflexión hasta el día de hoy en temas de diagnóstico, recordó el gerente general de ADL Diagnostic Chile, MV Patricio Bustos, “y aunque a inicios del año 2000 ya existía la tendencia a la migración de PCR convencional a PCR en tiempo real, ésta era muy lenta. No fue hasta el 2008, con la llegada del virus ISA a Chile, que el diagnóstico molecular aceleró su evolución a nivel nacional y tomó real protagonismo con la introducción del PCR tiempo real con química TaqMan”, aclaró el ejecutivo. A su vez, el gerente general de Diagnotec S.A., Javier Moya, en relación a la técnica diagnostica que utilizan en el laboratorio dijo que, “actualmente utilizamos PCR tiempo real, los cuales detectan todas las cepas que existen publicadas, excepto una de Australia”, aclaró el ejecutivo. “El diagnostico de PCR en tiempo real con sonda TaqMan es altamente específico, por lo que no permite errores de lectura, por lo tanto, se toma el segmento 8 del genoma del virus, que es poco variable. Sin embargo, siempre es bueno tener técnicas complementarias, para ver si te pueden arrojar más información”, complementó Moya. En el laboratorio de Aquagestión, complementariamente a disponer de PCR convencional y tiempo real, tenemos secuenciadores para poder identificar con mayor exactitud los serotipos y la secuencia del virus” detalló el gerente general de Aquagestion, Eduardo de la Fuente, además, el ejecutivo agregó que “tenemos un centro experimental, en el cual muchas veces estudiamos los postulados Koch en peces bajo condiciones controladas. El Laboratorio Antares (A.lab) cuenta con PCR convencional y PCR en tiempo real para el diagnostico de ISAv. “tenemos oficializado con Sernapesca el uso de la química de sondas Taqman, pero también tenemos sistema utilizando química SybrGreen, puntualizó el jefe técnico y comercial del laboratorio, Alexis Martínez. “Debido a que el ensayo TaqMan se basa en la hidrolisis de una sonda, como reacción no es del todo informativa, es decir, sólo tienes positivo o negativo. O puedes tener negativos con Ct (Threshold Cycle), si se contextualiza, pero un gel o una curva SybrGreen es muy informativo sobre la concentración del material genético y la performance de la reacción de amplificación, cuánto material genético cargaste a la reacción, la calidad. Todo eso puede influir. Por este motivo es importante complementar las técnicas diagnósticas”, añadió el especialista.

Factores influyen en el diagnóstico de ISAv Hoy en día la tecnología aplicada al diagnóstico de ISAv nos ha llevado a contar con una técnica sumamente robusta, sin embargo es evidente que algunos factores repercuten en mayor o menor medida en los resultados de las muestras a ensayar. Contar con una buena muestra cuando comienza el protocolo de análisis es fundamental para que el resultado de este sea confiable y repetible, expresó Marcela Lara desde Sernapesca.

1Snow, M., Raynard, R.S., Murray, A.G., Bruno, D.W., King, J.A., Grant, R., Bricknell, I.R., Bain, N.and Gregory, A. (2003) An evaluation of current diagnostic tests for the detection of infectious salmon anaemia virus (ISAv) following experimental water-borne infection of Atlantic salmon, Salmo salar L. Journal of Fish Diseases 26, 135–145.

Muestreo Para Marcela Lara, elegir bien al animal del que vamos a extraer la muestra es esencial. Del mismo modo, Lara agregó que entre otros requisitos, “es importante hacerlo en un lugar que reúna una serie de condiciones o, al menos, las básicas para realizar un muestreo, mantener las condiciones de asepsia para evitar la contaminación de las muestras, hacer el procedimiento de muestreo con los implementos adecuados, contar con contenedores con el preservante adecuado para el análisis que se va a realizar”. En este mismo sentido, Eduardo de la Fuente sugirió que hay que tomar los resguardos, para que si una muestra es positiva, no llegue al laboratorio negativa. A su vez, Javier Moya, afirmó que todos los laboratorios tienen un control de calidad de muestra al ingreso del laboratorio. “En cierta forma uno tiene que ser acucioso en determinar si la muestra está calificada o no para ser analizada. Es preferible, si la muestra no cumple con el control de calidad, rechazarla en ese minuto y volver a planificar el muestreo, que seguir adelante con la muestra, porque lo más probable que los controles con los housekeeping indiquen que la muestra no sirve”, advirtió el ejecutivo. En este sentido, Patricio Bustos, coincide en que ISA es un virus mucho más frágil si lo comparamos con IPNv, por lo tanto, influyen enormemente todas las condiciones desde la toma de muestra hasta el análisis, “influye si el pez está vivo o muerto, los órganos que se toman, el fijador o estabilizador que se utiliza, la temperatura de almacenamiento, sucesivas congelaciones y descongelaciones, así como el tiempo transcurrido hasta su análisis” reveló el profesional.

Transporte Según Marcela Lara, es importante que el traslado de las muestras hacia el laboratorio sea de tal forma que asegure el menor tiempo de traslado posible y la mantención y preservación de las condiciones de las muestras, así como su identificación. “Si la muestra llega en un plazo menor a ocho horas y en una cadena de frío bien establecida, prefiero que la muestra venga fresca” aclaró Alexis Martínez. Generalmente, los laboratorios ocupan etanol o ARN-later, que son procesos de fijación de la muestra, luego cuando tienes que realizar la extracción tienes un tejido duro, el cual es incómodo de trabajar”, agregó el profesional, añadiendo que en el laboratorio A.Lab utilizan Trizol, autorizado por Sernapesca, el cual es un solvente orgánico que degrada toda la organización celular y estabiliza el material genético desde la toma de muestra, y al llegar el laboratorio facilita el proceso de extracción.

Extracción de material genético Otro punto crítico dentro de las etapas que comprende el diagnóstico final, se encuentra en la extracción de material genético (ARN) es tener una buena calidad y concentración. Según explicó Martínez, “la calidad pureza se mide en un espectrofotómetro (Nanodrops), utilizando razón de absorbancia a 260 y 280 nm (A260/A280). Un RNA de buena calidad se debe tener valores en el rango de 1,9 a 2,0. Luego de esta prueba, el material genético pasa a amplificación” detalló el bioquímico de A.lab. Además, nuestro laboratorio en la etapa de amplificación de ISAv y factor de elongación, trabaja con un Kit para amplificación de pocos pasos, “todo está diseñado para disminuir los pasos y disminuir los puntos de error”, aseguró el profesional. Validación de las pruebas de diagnóstico de ISAv En general, las técnicas de diagnóstico deben ser sometidas a una validación, antes de comenzar a ser utilizadas, cumpliendo con un conjunto de estudios dirigidos a demostrar la idoneidad de la técnica para el objetivo requerido. Sernapesca, basándose en los estándares de validación recomendados por la OIE, estableció una norma técnica propia de validación denominada LABD/NT-3, la cual debe ser seguida por los laboratorios de la Red del Servicio en forma previa a la utilización de estas técnicas, en el marco de los programas oficiales de vigilancia y control. Esta norma incluye una serie de parámetros, con los cuales se mide la eficacia de cada una de ellas, tales como la sensibilidad y especificidad, tanto analíticas como diagnósticas; los valores predictivos, tanto de positivos como de negativos; repetitividad; reproducibilidad; robustez; rangos; entre otras. Adicionalmente a lo anterior, se realizan periódicamente pruebas de comparación inter-laboratorios (Ring Test), los cuales son organizados, coordinados y desarrollados por el Laboratorio de Referencia a petición de la Autoridad (Sernapesca) y consisten en preparar un panel de muestras con un resultado conocido, el que es enviado a diferentes laboratorios para comparar las capacidades diagnósticas y, considerando los resultados obtenidos por cada laboratorio, el Servicio mantiene la autorización de éste para realizar análisis oficiales.

2Snow M., Mckay P., Mcbeath A. J. A., Black J., Doig F., Kerr R., Cunningham C. O., Nylund A. & Devold M. (2006). Development, application and validation of a taqman® real-time RT-PCR assay for the detection of infectious salmon anaemia virus(ISAv) in Atlantic salmon (Salmo salar), Vannier P. & Espeseth D., eds. New Diagnostic Technology: Applications in Animal Health and Biologics Controls. Dev. Biol., Basel, Karger. 126, 133– 145.