Aguas contaminadas con Didymo generan cambios en la activación de espermatozoides de Salmo salar: efectos en la producción

Jorge Parodi¹*& Matías Peredo-Parada^2,3

Introducción

Didymosphenia geminata (D. geminata) es una diatomea unicelular bentónica. Esta microalga, conocida como “didymo” en Chile, ha sido encontrada en las aguas de los ríos del sur de Chile (Rivera y col., 2013), y ha sido considerada como una plaga en fuentes de agua dulce por el Estado de Chile y genera su plan de manejo, según Res. Ex. 1866 (Reid y col., 2012). Estudios internacionales indican que D. geminata altera el microambiente y reduce la población de peces (Clearwater y col., 2010), además perturba comunidades acuáticas de macro vertebrados y los filtros de sistemas de aguas potables (Kilroy y col., 2009, Bergey y col., 2010, Gillis y Chalifour, 2010), aunque se desconoce si es un efecto directo de la contaminación. Recientemente, se describió un efecto tóxico de la microalga sobre comunidades de macroinvertebrados en los ríos contaminados y debemos considerar que la remoción de la microalga también introduce daños en los cursos de agua (Larned y Kilroy, 2014). En nuestro país no hay estudios que confirmen estos antecedentes, y debemos controlar estos efectos con el desarrollo de investigación de laboratorio que apoye las observaciones de campo y asumir que las condiciones se podrían replicar, desconociéndose sus efectos completos en la microflora y en peces en el mundo y en Chile (Rivera y col., 2013). Los espermatozoides de peces son inmóviles en el eyaculado, sólo después de sufrir un shock osmótico en el agua se activan y comienzan a moverse o nadar (Alavi y col., 2009). En laboratorio se replica esto, usando agua de ríos o soluciones comerciales, que generan que los espermatozoides comiencen a nadar (Figueroa y col., 2013), observándose diferentes parámetros cinéticos cuantificables, entre ellos, el tiempo de movilidad de la masa de espermatozoides, el cual puede medirse en forma manual (Ubilla y Valdebenito, 2011) o por sistemas computarizados (Hu y col., 2013). Ésta es una forma de medir su función celular y conocer los efectos de moléculas en su función, ya que la motilidad y viabilidad de los espermatozoides están relacionadas (Parodi, 2014). Esta microalga, perteneciente a la familia de algas cafés de las diatomeas, es rica en algunas moléculas bioactivas como la diadinoxantina (Lohr y Wilhelm, 1999). Interesantemente, en muchas investigaciones se describen los beneficios de las sustancias bioactivas en modelos celulares, sin embargo también se describen sus efectos tóxicos sobre células cancerígenas (Korkina y col., 2009), lo que indica que ciertas dosis pueden ser letales para determinados grupos celulares. Debemos recordar que la dosis define perfectamente el efecto positivo o negativo de una molécula en un modelo celular. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de D. geminata en la activación de espermatozoides de salmón Atlántico.

Métodos

Recolección de muestras de D. geminata

D. geminata se recolectó en los ríos Futaleufú y BioBío, en invierno y primavera del 2014. Las muestras fueron transportadas hasta el laboratorio en cajas plásticas, cerradas, en oscuridad, a 10 °C. De los ríos también se recolectó agua y sustrato (bolones de río) colonizados por la microalga.

Las muestras recolectadas fueron mantenidas en acuarios, sistemas cerrados de recirculación de agua, que denominamos ríos artificiales, para su observación en laboratorio. En los ríos artificiales se dispusieron las rocas contaminadas con D. geminata, agregando un 50% del agua del río contaminado con la microalga, más un 50% de agua destilada (volumen total de 14 litros), procurando dejar una columna de agua de 15 cm sobre las rocas.

Colección y manejo de las muestras de semen

Las muestras de semen fueron obtenidas de reproductores manejados por la empresa Bioacui- UCT. Las muestras fueron manipuladas siguiendo las normas de ética y bioseguridad descritas en el proyecto Fondef de Conicyt, dirigido por el Dr. Valdevenito. Todos los procedimientos fueron realizados a 4 °C. Para su observación, las muestras fueron montadas en un portaobjeto, al agregando 10 ?l de semen de salmón Atlántico para luego montar rápidamente sobre el microscopio. Una vez enfocada la muestra, se aplicaron sobre ésta 20 ?l de agua de pozo, agua de río, agua de río contaminada y con el activador Powermilt, el cual es diluido con agua destilada (1X). Se procedió a evaluar el tiempo desde el comienzo del movimiento espermático, hasta que la totalidad de las células del campo visual dejaran de moverse. Sus cinéticas fueron analizadas por un sistema CASA (Computer Assisted Sperm Analyzer), del software libre ImageJ.

Resultados

Modelo de mantención de D. geminata en el laboratorio

En la figura 1A se observa el modelo para mantener D. geminata en el laboratorio. El agua de río contaminada se mantuvo circulando en estos sistemas de ríos artificiales que contenían rocas extraídas de los ríos (figura 1B). Con el fin de registrar si existía D. geminata en estos ríos artificiales, fueron monitoreados tres puntos de observación, como se muestra en la figura 1A. El recuento de formas viables de D. geminata se reduce después de 40 días de conservación. Esta evidencia sugiere que podemos mantener valores viables de 50% de D. geminata por meses, pudiendo usarse como fuente de D. geminata para estudios de laboratorio.

Efecto de la presencia de D. geminata en la viabilidad y función de espermatozoides

D. geminata no ha sido identificada como un agente tóxico. Se ha sugerido que altera la ecología de ríos, pero por mecanismos que no son claros y que aún no están descritos en la literatura científica. Los espermatozoides de peces, en general, son células muy lábiles, altamente sensibles a cambios ambientales (Cabrita y col., 2011).

En las microfotografías de la figura 2A se observa que no hay un aumento en el número de células muertas al ser expuestas a aguas de ríos contaminados con D. geminata, ni cuando se usó agua de ríos artificiales. En la figura 2B se observa una cuantificación de las microfotografías, no observándose cambios significativos en ninguna de las condiciones.

Estos hallazgos sugieren que didymo no induce muerte celular en este modelo.

En la figura 3A, se puede observar que el agua que contenía D. geminata reduce en un 50% el tiempo de activación al compararlo con agua de río (control). Para completar este estudio, se evaluó el efecto de la presencia de D. geminata en el tiempo de conservación de las muestras. La figura 3B muestra una curva de progreso del efecto del tiempo en la viabilidad en células control, que son activadas con agua de río, con Powermilt (una solución comercial) y con agua contaminada con D. geminata. Pasados los días de conservación de las muestras de espermatozoides, se vuelven más sensibles a la presencia de D. geminata, lo que podría afectar su viabilidad por mecanismos que aún no han sido descritos.

¿Es posible que el agua de ríos contaminados con D. geminata afecte la activación con Powermilt?

Para evaluar esto, se construyó una curva de concentración V/V de Powermilt diluido con agua de ríos contaminados con D. geminata, observando que existe un efecto del tipo dosis/respuesta y que la dilución del Powermilt con este tipo de agua reduce su efecto con IC50 de 15 ± 0,7, en el tiempo de activación, como se muestra en la figura 3C. Esta evidencia nos sugiere que las aguas contaminadas con D. geminata alteran el tiempo de activación en las muestras de espermatozoides, posiblemente por la liberación del algún compuesto, que incluso puede inhibir el efecto potenciador de soluciones comerciales como el Powermilt.

Observación de la cinética de espermatozoides en presencia de aguas contaminadas con D. geminata

Usando protocolos de bajo costo, implementados en el laboratorio (Parodi y col., 2014, manuscrito en prensa observamos cambios cinéticos, en particular sobre los valores de VCL, VSL y la VAP. Los datos previos indican un cambio en el tiempo de activación, sin afectar la viabilidad de las muestras. En la figura 4A se observa un registro de los trazos del movimiento de los espermatozoides en las diversas condiciones de activación. La figura 4B muestra la observación de la VCL en las distintas condiciones, no observándose cambios significativos en las muestras, las figuras 4C y 4D muestran los gráficos para VSL y VAP donde tampoco se apreciaron cambios significativos en los parámetros cinéticos, sin embargo, al evaluar la movilidad progresiva se observa una reducción de un 50% en presencia de D. geminata, como se resume en la figura 4E. Estos experimentos sugieren que no hay efecto en la cinética de activación de los espermatozoides cuando se usa agua contaminada con D. geminata.

Exploración de mecanismo, participación de polifenoles

Los polifenoles se extrajeron a partir de muestras de D. geminata mediante protocolo descrito en Jofre-Fernández y col., 2013 (Jofré y col., 2013). La figura 5A muestra una imagen confocal, donde se observa en verde y rojo el contenido orgánico de D. geminata. En la figura 5B observamos el contenido de polifenoles en diversos extractos de D. geminata. Estos extractos fueron usados en experimentos, donde se observó el tiempo de activación de los espermatozoides expuestos a concentraciones crecientes de éstos, encontrando una dosis IC50 del tiempo de activación de 10 ± 0,7 ppm, como se muestra en la figura 5C. Estos hallazgos sugieren que D. geminata puede reducir el tiempo de activación a través de la liberación de polifenoles en los ríos y que existe un efecto dosis/respuesta en la función de espermatozoides de salmón Atlántico cuando se usa este tipo de extracto.

Discusión

Los resultados de este estudio sugieren que existe un efecto del agua contaminada con D. geminata sobre el tiempo de movilidad de los espermatozoides de Salmo salar. Se observó una disminución del tiempo de activación y en el porcentaje de células motiles, sin afectar la viabilidad de los espermatozoides ni la cinética de los espermatozoides. Se sugiere que estos efectos podrían estar mediados por el contenido de polifenoles presente en D. geminata. El contenido orgánico de D. geminata ha demostrado ser rico en antioxidante y polifenoles como la diadinoxantina. Este tipo de moléculas tiene efectos celulares que, según su concentración, podrían ser benéficos o tóxicos. En las muestras mantenidas o recuperadas desde río pudimos evidenciar que existe una proporción de unos 200 ppm de polifenol por cada 10 gramos de D. geminata, lo cual es sugerente que el efecto observado en los espermatozoides activados con aguas contaminadas con D. geminata sea mediado por la presencia de polifenoles, pero no podemos descartar otros mecanismos de acción que podrían alterar la función celular. Estudios recientes han sugerido efectos más tóxicos de D. geminata sobre vertebrados (Richardson y col., 2014) y en comunidades bentónicas de ríos (Gillis y Chalifour, 2010). o de los tratamientos utilizados para su remoción (Larned y Kilroy, 2014), pese a esta información los efectos de la microalga son recién explorados.

Referencias

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¹Laboratorio Fisiología de la Reproducción, Escuela de Medicina Veterinaria, Núcleo de Investigación en Producción Alimentaria, Facultad de Recursos Naturales, Universidad Católica de Temuco.

²Departamento de Ingeniería en Obras Civiles, Universidad de Santiago de Chile.

³Plataforma de Investigación en Ecohidrología y Ecohidráulica, EcoHyd Ltda.