Dietas nutricionales

funcionales de peces en las células SHK-1: Los efectos protectores de un aditivo comercialRodrigo Sanchez1,4, Pamela Olivares1, Erico Carmona2, Allisson Astuya3 , Hector Herrera4 & Jorge Parodi1*1Laboratorio Fisiología de la Reproducción, Universidad Católica de Temuco.2Laboratorio de Genotoxicología, Universidad Católica de Temuco.3Laboratorio de Cultivo Celular y Genómica Marina, Universidad de Concepción.4Empresa Vitapro Chile, Salmofood Castro, Región de los lagos, Chile.

Publicado Actualizado

Introducción

En nutrición de especies productivas, los aditivos disponibles buscan favorecer diferentes procesos fisiológicos, pero es necesario comprender en detalle los mecanismos por los cuales operan y sus efectos.

El presente estudio busca evaluar los efectos citotóxicos de un aditivo usado ampliamente en la industria de alimentos en salmonicultura, que por registro de marca hemos denominado como aditivo comercial (AC), para lo cual se utilizó una línea de células SHK-1 derivadas de riñón anterior de salmón Atlántico (Salmo salar) como modelo biológico, exponiéndola al AC en concentración y tiempo creciente, para evaluar por MTT y por número de células, sus efectos en la viabilidad celular. Además, se usaron modelos de estrés oxidativo para conocer efectos protectores del AC contra esos agentes. Los datos indican que dosis de 100 ppm del AC son suficientes para estimular proliferación celular. Los cultivos fueron expuestos a alta glucosa (15 mM)  y Peróxido de Hidrogeno (H2O2 0,1 mM) en presencia o ausencia de AC a 100 ppm, observando que los efectos tóxicos de ambos compuestos eran bloqueados por la presencia del AC. Los resultados mostraron que la evaluación de aditivos a nivel celular permite lograr recomendaciones aplicables en acuicultura, y que el AC, tiene efectos proliferativos y reduce el estrés oxidativo en estos modelos.

 

Líneas celulares, un modelo de estudio

Los cultivos celulares son importantes para la investigación en peces, y en vertebrados en general, ya sea en la exploración de aditivos, su interacción con órganos, y la aparición de efectos secundarios, proporcionando material biológico ilimitado en el diagnóstico de alteraciones producidas por éstos [1, 2]. Aunque es novedoso en la acuicultura, el traspaso de información desde células a modelos complejos es algo común en mamíferos [3]. Es por esto que conocer los efectos de estos compuestos a nivel celular, en modelos de cultivos de peces, es una opción para mejorar la comprensión de la fisiología de los mismos y evitar toxicidad por aplicaciones crónicas [4, 5]

En peces se usan diversos aditivos comerciales como antioxidante, pero no está ampliamente estudiado a nivel celular el efecto de estos compuestos [6], se usan en dietas como un aditivo que potencia el desarrollo y crecimiento [7], su uso en dietas es diverso, puede usarse en desarrollo para peces en agua dulce [8] o ya en engorda, en agua de mar [7], se ha usado como inmumodulador [9] o como protector contra agentes injuriantes, como curcumina [6], y puede regular función en células gliales de peces [10]. Su mecanismo de acción en peces se desconoce, se identifica como un aditivo que se absorbe como un flavonoide por la pared intestinal y por un mecanismo antioxidante no descrito o por ser un quelante de metales, mejorando la función celular y el desarrollo de peces [6, 9].

En este estudio, primero de una serie de trabajos, se trataron células SHK-1 derivadas de la zona anterior de riñón de salmón Atlántico, en concentraciones y tiempo crecientes del AC.

Métodos

Cultivo celular y estudios citotóxicos

Línea celular derivada de leucocitos de salmo salar SHK-1 (Ecacc N° 97111106), fue mantenida en incubadora a 17 °C. Las células fueron cultivadas en medio de cultivo Leibowitz L-15 y suplementado con un 10% de suero fetal bovino, glutamina 1%, penicilina/estreptomicina 1% y 2-mercaptoetanol 72 uL/ml. Los procedimientos de expansión celular se realizaron en un gabinete de bioseguridad. Los cultivos fueron expuestos a curvas temporales (1 a 7 días) y de concentración (0,1 a 1.000 ppm) de AC genérica para evaluar su toxicidad, coloración supravital y morfología (citoquímica), para explorar su reacción y mecanismo de respuesta al aditivo. Modificado de los descrito por Jofré y col., 2013 [11], se incorporó el efecto de alta glucosa por 24 h., 30 mM, para generar radicales libres y por 7 días para generar estado de oxidación. Además, se usó 100 µM de H2O2, en 24 hrs y crónico (7 días) para observar el efecto directo de radicales libres y la acción de antioxidantes en los aditivos.

Proliferación celular

Las células fueron lavadas con PBS y despegadas con una solución de tripsina al 1%,  luego se recogieron en medio cultivo completo para inhibir la tripsina. Éstas se colectaron en tubos estériles de 15 ml y fueron centrifugadas a 1.200 rpm por 10 minutos. Las células en el fondo se suspendieron en 1 ml de medio base y se tomó una muestra para ser recontadas en un hemocitómetro diluido en 1/100. Con este valor se sembró en una densidad de 100 mil células por ml, en placas de cultivo de  1,6 mm de diámetro, con 250 µl de medio. Este cultivo se expuso por 24 hrs a los aditivos y fue recontado el número de células por área. Se informa la densidad de células por área como indicador de cambio en la proliferación celular o tasa de crecimiento, modificado de Parodi y col., 2002 [12].

Análisis de viabilidad por MTT

Las células crecidas en placas de cultivo fueron expuestas a curvas temporales y de concentración de los aditivos, luego lavadas del medio de cultivo e incubadas c de solución de trabajo MTT.  La solución stock de trabajo fue  5 mg/ml (12 mM) y 0,5 mg/ml (1,2 mM). Se incubó por 2 horas a 17 ºC para permitir la formación de cristales de formazan, luego se eliminó el sobrenadante y fue añadido 150 µl de DMSO por pocillo. Se dejaron los cultivos a temperatura ambiente, hasta que los cristales de formazan fueran disueltos. Se tomó el volumen y se agregó 300 µl de agua destilada. Se leyó la absorbancia en espectrofotómetro  (Spectroquant  Pharo 300, Merck) a DO 570 nm, contra blanco de reactivo (150 µl DMSO más 300 µl Agua). El blanco de agua del equipo fue usar esta mezcla llevarla a cero y medir para asegurar un buen blanco, se normalizaron los resultados con respecto al control y se expresó en porcentaje de viabilidad.

Análisis de datos

A menos que sea indicado, los resultados, incluido los análisis de imágenes, son presentados como el promedio ± SEM. Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando el test de Student o Anova. Un nivel de probabilidad (P) menor a 0,05 es considerado estadísticamente significativo.

Resultados

AC promueve la proliferación celular en forma concentración respuesta. Sembramos células y observamos a tiempo cero el número de células por  área, el efecto de agregar 150 ppm en ese tiempo. La figura 1A muestra una imagen ejemplo de la condición control y de los cultivos tratados con 150 ppm del AC, a tiempo cero y a los 5 días de éstos, observando un aumento en el número de células por área. La figura 1B representa una cuantificación a diferentes tiempos del número de células por área, donde se observa un aumento en el número de células. En la figura 1C se observa cuantificado el efecto agudo de 150 ppm del AC y representado en la figura 1D, donde no se observa un efecto deletéreo sobre el cultivo al ser expuesto agudamente.

Figura 1. Efecto en la proliferación celular. En A, ejemplo de microfotografías en control y con el aditivo comercial 150 ppm, a tiempo 0 y 5 días. B, cuantificación del número de células después de 5 días de cultivo en ausencia o presencia del aditivo comercial. C, número de células del cultivo expuesto a 150 ppm de aditivo comercial durante 24 h. D, imagen representativa de la cuantificación a las 24 h con el aditivo comercial.

AC reduce los efectos de alta glucosa

Observando que la glucosa a 30 mM altera la viabilidad de los cultivos, probamos cuál era su efecto cuando se mantenía en presencia de AC 100 ppm. La figura 3A muestra imágenes de cultivos expuestos por 7 días a alta glucosa, en ausencia y presencia de AC. La figura 3B muestra la cuantificación del número de células, donde se observa una reducción del efecto glucosa cuando el cultivo es expuesto a 100 ppm del AC.  Con el fin de determinar si el efecto es concentración dependiente, los cultivos expuestos a 30 mM de glucosa por 24 h, fueron incubados en concentraciones crecientes de AC (1 a 250 ppm), como muestra la figura 3C. Al usar la concentración en forma crónica y evaluando la viabilidad por MTT, como se muestra en la figura 3D, observamos que 100 ppm es suficiente para reducir significativamente el efecto de 30 mM de glucosa en  las células.

Figura 3. Efecto protector contra glucosa elevada. En A, ejemplo de microfotografías en glucosa 30 mM y en presencia o ausencia de aditivo comercial 100 ppm, a tiempo 0 y 7 días. B, número de células en alta glucosa ausencia o presencia del aditivo comercial 100 ppm. C, efecto de glucosa 30 mM en ausencia o presencia de concentraciones crecientes del aditivo comercial. D, efecto en la viabilidad celular con glucosa 30 mM en ausencia o presencia de aditivo comercial.

AC reduce los efectos de peróxido de hidrógeno

En la figura 4A se ven imágenes de un cultivo expuesto a H2O2 0,1 mM en ausencia y presencia del AC 100 ppm. La figura 4B muestra una cuantificación del efecto crónico del H2O2 en el cultivo en la ausencia y presencia del AC, observando que después de 7 días de co-incubacion, el número de células  aumenta con respecto al cultivo expuesto a H2O2.  Al evaluar la viabilidad en el cultivo por MTT en aplicaciones agudas, observamos que el AC reduce los efectos de H2O2 en forma concentración dependiente, como se muestra en la figura 4C.

Figura 4. Efecto antioxidante. En A, ejemplo de microfotografías H2O2 0,1 mM en presencia o ausencia del aditivo comercial 100 ppm. B, cuantificación del número de células después de 7 días de cultivo en H2O2 0.1 mM en ausencia o presencia del aditivo comercial 100 ppm. C, efecto de H2O2 0,1 mM durante 24 h en la viabilidad celular en ausencia o presencia del aditivo comercial.

Discusión

Hemos encontrado que el AC que no altera la viabilidad celular y promueve la proliferación en esta línea celular (fig 1) en forma concentración respuesta, con un valor de EC50 de 105 ppm (fig 2A). Se describe a algunos aditivos comerciales como buenos antioxidantes [13] y que puede cumplir esa función en peces [6], evaluamos los efectos de un AC en cultivos expuestos a alta glucosa, que promueve condiciones de estrés oxidativo (fig 2B) y encontramos que los efectos de glucosa se reducían cuando el cultivo era expuesto al AC 100 ppm (fig. 3B) y este efecto se presentó en forma de concentración dependiente (fig. 3C), mostrando que valores de 100 ppm del AC, protegen el cultivo.

Figura 2. Efecto concentración respuesta. En A, curva de concentración respuesta, proliferación a los 5 días con aditivo comercial 0,1 a 1000 ppm, se observa un EC50 de 105 ppm para la proliferación. B, viabilidad celular de cultivos expuestos concentraciones crecientes de glucosa.

Con el fin de conocer el efecto directo en los cultivos de los radicales libres y si el AC podía reducir su toxicidad, los cultivos fueron expuestos a 0,1 mM de H2O2, en ausencia  y presencia del AC 100 ppm (fig. 4B). Observamos que el AC reduce la mortalidad del cultivo, protegiéndolo de la condición de estrés oxidativo y este efecto también es concentración dependiente (fig. 4C), como lo observado con glucosa y que valores del AC menores de 100 ppm, no reducen el efecto de H2O2, aumentando la mortalidad en esas condiciones.

Los hallazgos indican que concentraciones de 100 ppm del AC son suficientes para promover la división celular en células SHK-1 y que, tras ser expuestos a 0,1 mM de H2O2, reducen significativamente los efectos de estrés oxidativo. Estos resultados son  de aplicación práctica en la formulación de dietas para peces, de manera de estimar eficazmente la concentración en los preparados, para generar esta biodisponibilidad y comprender los efectos que tendrá en el cultivo de peces el uso de esta molécula.

Vitapro, una empresa involucrada en investigación y desarrollo

El estudio de la nutrición de peces es un campo relativamente nuevo de la fisiología y en Vitapro, nos hemos comprometido en conocer en detalle cómo funcionan nuestros aditivos para así poder entregar la mejor asesoría. La alianza con diferentes investigadores nacionales y extranjeros nos han permitido fusionar diferentes conocimientos y potenciar la investigación en diferentes materias. Uno de nuestros colaboradores, el Dr. Jorge Parodi, Investigador de la Universidad Católica de Temuco, está desarrollando, en conjunto, una serie de trabajos con el fin de comprender cómo aditivos usados en nuestras formulaciones, generan cambios celulares que se traducirán en efectos sobre el desarrollo de los peces en cultivo. Esta innovación nos permite entender en forma local y más completa los efectos de nuestros productos y racionalizar mejor nuestras formulaciones, con objeto de  consolidar nuestro conocimiento y experiencia, para comprender mejor aún la nutrición y fisiología de los peces, y dar respuesta a las crecientes necesidades de nuestros clientes con una sólida base científica.

Referencias

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