Primera vacuna comercial contra el avance del piojo de mar: Providean Aquatec Sea Lice innovación tecnológica, protección y blindaje biológico contra el Caligus

En julio del 2014, la compañía biofarmacéutica Tecnovax registró en Chile la vacuna Providean Aquatec Sea Lice, cuyos resultados fueron evaluados por el Servicio Agricola y Ganadero (SAG) y el Servicio Nacional de Pesca y Acuicultura (Sernapesca) considerándola eficaz y segura para su utilización.

Caligus, principal amenaza contra la producción salmonicultora

Caligus rogercresseyi, crustáceo maxilópodo perteneciente a la familia Caligidae, que afecta la principalmente la producción de salmón Atlántico (Salmo salar) y trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss), vulnera la primera barrera de defensa: la superficie mucosa de la piel. Las lesiones epidérmicas conllevan al desbalance osmótico, estrés crónico, inmunosupresión, menor tasa de conversión de alimento, incremento de la susceptibilidad a patógenos como Piscirickettsia salmonis (SRS), y el riesgo de transmisión horizontal del virus de la Anemia Infecciosa del Salmón (ISAv).

Los costos en la aplicación de medidas de control del parásito se estiman en US$ 30 millones en antiparasitarios por año y no son la solución al problema, ya que se traducen en complicaciones operativas, presión selectiva y alta velocidad de reinfestación, forzando a finales del 2007 a una rápida migración hacia nuevos principios activos de mayor costo económico y alto impacto ambiental.

En 2009, se implementaron cambios regulatorios como el control de la carga parasitaria en terreno, la implementación de baños con lona cerrada y el cierre y rotación de centros de cultivo. Es decir, la lucha contra el Caligus demostró ser económicamente costosa, regulatoriamente compleja y técnicamente inviable si no se la combina con nuevas herramientas de control.

Providean Aquatec Sea Lice, una estrategia de control a largo plazo

Ésta es la primera vacuna comercial indicada para reducir la carga parasitaria de Caligus rogercresseyi en salmónidos.

Una estrategia de control a largo plazo debe focalizarse hacia la reducción de la biomasa parasitaria del medioambiente a lo largo del tiempo. La combinación integral de antiparasitarios, con vacunas que estimulen la respuesta inmune de pez y la generación de un escudo mucoso, como una protección biológica contra la infestación, demostró ser la herramienta más efectiva.

Por esta razón, Tecnovax desarrolló una vacuna de última generación, cuyo principio activo es una antígeno subunitario sintético conjugado con una “mega” proteína de tipo Keyhole limpet hemocyanin (KLH) y formulado en una emulsión oleosa preventiva y activadora de la respuesta inmunológica de salmónidos.

Blindaje biológico

La formulación peptídica induce un aumento de la densidad del mucus y el número y diámetro de células secretoras, generando un escudo biológico contra la infestación por el piojo de mar Caligus rogercreseyi, reduciendo en un 75,5±14 % (con respecto al control) el recuento de estadíos juveniles y adultos post-desafío con el parásito en los salmónidos vacunados.

Su eficacia, seguridad y duración de la inmunidad fue validada en más 18 ensayos clínicos en especie blanco, cuyos resultados fueron evaluados por el SAG y Sernapesca quienes aprobaron la vacuna en julio de 2014, considerándola eficaz y segura para su utilización.

En ensayos realizados en (n=100) salmón Atlántico (Salmo salar) (50-60 g) y en trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) (20-40 g) vacunados con el lote experimental 001 y desafiados entre las 600-900 UTA con 100 copepoditos por pez (11-14 °C) se observó:

• La inducción de los títulos de anticuerpos específicos en suero y mucus en función del tiempo en los peces vacunados vs el grupo control

• La reducción en el porcentaje de infestación de los peces vacunados vs controles post-desafío con Caligus rogercresseyi.

• Cambios histológicos en la epidermis, tales como el aumento en el número y diámetro de células secretoras de mucus y el aumento en el espesor del epitelio de los peces vacunados vs controles post-desafío con Caligus rogercresseyi.

Validación de la eficacia Escudo mucoso

Las observaciones realizadas se basaron en la determinación del número de células secretoras de mucus, su diámetro y grosor de la pared, analizando tres campos por corte histológico de piel de peces vacunados y controles. Se realizó un tratamiento estadístico de los resultados, de acuerdo con el método de Kruskal Wallis por diferencia de medias. Las muestras histológicas se colorearon con hematoxilina-eosina. Al inicio de la inmunización, los cortes de ambos grupos se colorearon con igual intensidad, predominando los mucopolisacáridos neutros. Entre 100 y 600 UTA, el mucus de los peces inmunizados con ésta vacuna se tornó 3,3 veces más denso y presentó mayor filancia y acidez (Fig. 1).

En la Figura 2 se observa que en el grupo vacunado el espesor del epitelio, así como el número y diámetro de células PAS+ mostró una tendencia a aumentar durante el transcurso del ensayo con respecto al tiempo inicial y se mostró ligeramente mayor a partir de las 200 UTA. A 400 UTA se observó un mayor número y diámetro de células secretora de mucus, no habiendo espacio para células epiteliales, sólo para células mucosas, acompañado de un engrosamiento significativo del epitelio en los peces vacunados con el producto, con respecto al tiempo inicial. Se observó hiperplasia de las células secretoras de mucus frente al estímulo inmunogénico. No existen diferencias significativas en el espesor del epitelio y el número de estas células en cortes histológicos de peces controles sin vacunar en los diferentes tiempos muestreados. A las 600 UTA, se observa la activación de macrófagos y el aumento del infiltrado linfocitario que coincide con el aumento de los títulos de anticuerpos séricos específicos, es el tiempo de preparación de la respuesta inmune especifica que se potencia a 900 UTA (y es mayor que a los tiempos previos) aumentando 42% el espesor del epitelio, 52% el número de células secretoras de mucus y 39% el diámetro de estas células mucogénicas en los peces vacunados con el mencionado producto, respecto del control. A partir de las 800 UTA y hasta 1.200 UTA, no se observan diferencias significativas en los valores de grosor del epitelio, número y diámetro de células entre los grupos vacunados. Sin embargo, las diferencias son estadísticamente significativas si comparamos los mismos parámetros con los correspondientes a los grupos controles. Esto indica que el principio activo de esta vacuna, tiene actividad biológica específica en la generación de escudo mucoso que actúa como blindaje ante el desafío con Caligus rogercresseyi.

Inmunogenicidad

Se observa que durante el transcurso de la inmunización, los títulos de anticuerpos específicos inducidos en los peces vacunados con la serie 001 van aumentando, llegando a una meseta a las 900 UTA. A partir de allí, se alcanzan los mayores títulos séricos. La diferencia entre los títulos de anticuerpos séricos entre las 900-2.000 UTA es estadísticamente no significativa (Prueba T Student). Se puede ver que cierto nivel de anticuerpos es requerido para mantener la protección. Al momento del desafío (900 UTA), el nivel de anticuerpos séricos alcanza su máximo título, siendo suficiente un título correspondiente a 1 Log para inducir un grado de protección mayor al 60% en los peces desafiados.

Eficacia y protección

Se determinó la eficacia en la reducción de cargas de C. rogercresseyi del grupo vacunado versus el control, desde el desafío (900 UTA) hasta las 2.000 UTA (Fig. 4).

Se observó el efecto del escudo mucoso inducido por una dosis de 200 µg de la vacuna y el desarrollo de estadios tempranos y adultos de C. rogercresseyi frente al desafío con el parásito (100 copepoditos/ pez). A partir de las 700 UTA, se ve que la diferencia en las cargas entre el grupo vacunado y el grupo control es estadísticamente significativa. Se detecta una reducción de la infestación promedio de 45,9%, explicada por la tasa de fijación de C. rogercresseyi inicial y el curso de la inmunización durante el período de preparación de la respuesta inmune humoral/celular consecuencia de la vacunación. A medida que transcurren los tiempos de muestreo del ensayo, el porcentaje de reducción de la infestación se incrementa, alcanzando valores entre 73 y 82% desde las 800 a las 1.200 UTA, con un valor medio de 75,5%, contemplando todos los tiempos de muestreo. Esta situación se explica porque en los primeros tiempos de análisis existen estadios de C. rogercresseyi infectantes, los cuales se adhieren al pez en la tasa esperada, pero no alcanzan a desarrollarse en su totalidad en sus formas juveniles y adultas, asociándose este hecho al efecto de protección inducido por la vacuna. Sin embargo, en el grupo control no vacunado con el inmunógeno, se observa un aumento significativo y paulatino del desarrollo de estadios juveniles y adultos no observándose protección.

Validación de Seguridad

La aplicación intraperitoneal de la vacuna no modificó el comportamiento ni el apetito de los peces vacunados (salmón Atlántico (Salmo salar) de 40-45 g), no produjo reacción inflamatoria alrededor de los ciegos pilóricos y acinos pancreáticos ni de otros órganos de la cavidad abdominal. No se observaron reacciones locales en el sitio de inyección, ni daño en el tejido en ensayos de seguridad a simple y doble dosis monitoreados hasta los 2.255 UTA.

La vacuna resultó inocua y segura. No se asoció con la presentación de efectos secundarios significativos (adherencias y melanosis), logrando un equilibrio óptimo entre los beneficios de la inmunoprotección y los efectos no deseados (Fig. 5). A 2.255 UTA se observó:

• El 100% de los peces vacunados con doble dosis presentaron adherencias dentro de grado 1

• El 100% de los peces vacunados con doble dosis presentan melanosis parietal inferior a grado 1

• El 100% de los peces vacunados con doble dosis presentan melanosis visceral inferior a grado 1 La seguridad de la vacuna, combinada con Providean Aquatec 2-4 y 5 fue verificada en salmón Atlántico (Salmo salar) (40-45 g) en condiciones extremas de uso (dosis simple y doble) hasta las 1.500 UTA demostrando ser apta para su aplicación en forma simultánea.

Plan de vacunación

La vacuna registrada a la fecha para su uso en salmón del Atlántico (registro para trucha arcoíris en proceso) debe administrarse por inyección intraperitoneal a una dosis de 0,05 ml/pez, durante la fase de agua dulce, previo al traslado al agua de mar, con un peso mínimo de 20 gramos. Debe vacunarse al 100% de cada centro e, idealmente, de cada barrio y usarse en forma combinada con antiparasitarios y estrategias de manejo como el descanso de centros. La vacuna por ser un producto biológico, combinada con los baños, apunta a la reducción de la biomasa parasitaria en el medioambiente a lo largo del tiempo.

Conclusiones

La vacuna desarrollada por Tecnovax es la primera en el mercado que protege al salmón de la infestación con Caligus rogercresseyi, reduciendo en un 75,5±14 % (con respecto al control) el recuento de estadíos juveniles y adultos post-desafío. Además, estimula el aumento sostenido de los títulos de anticuerpos específicos en mucus y suero en función del tiempo hasta los seis meses post vacunación y tiene actividad biológica específica en la generación de un escudo mucoso aumentando 42% el espesor del epitelio, 52% el número de células secretoras de mucus, 39% el diámetro de estas células mucogénicas, modulando la producción de mucus 3,3 veces más filante con respecto al control, que actúa como blindaje ante la presencia del parásito. Su eficacia y seguridad fueron verificadas satisfactoriamente en condiciones extremas de uso (dosis simple y doble) hasta las 2.255 UTA y en combinación con Providean Aquatec 2-4 y 5 hasta las 1.500 UTA resultando aptas para su uso simultánea.