Regulación circadiana del metabolismo de los lípidos en salmón Atlántico

Mónica B. Betancory Andrew DavieInstituto de acuicultura,Escuela de Ciencias Naturales, Universidad de Stirling, Escocia

Introducción Cada vez existe más evidencia que la mayoría de los organismos muestran ritmos, tanto diarios como anuales, en su bioquímica, fisiología y conducta. Los salmónidos no son la excepción; es bien conocido que presentan una manifiesta ritmicidad en rasgos claves para la producción, incluyendo reproducción, esmoltificación, apetito y actividad locomotora. Se acepta, generalmente, que tales comportamientos rítmicos se producen, en última instancia, bajo el control de relojes endógenos, los cuales son osciladores bioquímicos que se encuentran en todas las células. Estos sistemas de reloj son un aspecto poco estudiado, pero se cree que proporcionan una regulación interna a los cambios ambientales “predecibles”, como los ciclos de fotoperiodo (Migaud y col., 2010). Como tal, estos relojes permiten al organismo acoplar todos su procesos metabólicos y conductuales para estar en sintonía con los acontecimientos diarios predecibles. Actualmente, la investigación en salmónidos se ha centrado en la conexión de los sistemas de reloj con la regulación de eventos claves del ciclo vital, como la reproducción, la migración y la esmoltificación (por ejemplo Davie y col., 2009). Este estudio es uno de los primeros intentos por ampliar nuestra comprensión de los sistemas de reloj y poder explorar su posible papel en la regulación del metabolismo, que tiene gran importancia comercial en la producción acuícola intensiva. La acuicultura mundial está dominada por especies carnívoras, cuyas dietas naturales son ricas en proteínas y lípidos, siendo esta última la fuente de energía primaria (Sargent y col., 2002). Por lo tanto, la nutrición y el metabolismo de los lípidos en peces es de gran relevancia para la acuicultura y, dos de los temas más importantes en la dieta son el nivel y la fuente de lípidos (Tocher, 2003). Tradicionalmente, los lípidos en la dieta han sido suministrados a través del aceite de pescado, pero éste es un “commodity” finito y los suministros mundiales de aceite de pescado están en su límite máximo sostenible y no pueden mantener el desarrollo futuro de la acuicultura (Tacon y Metian, 2008). Como resultado, los aceites vegetales carentes de omega-3 y de colesterol, están reemplazando el aceite de pescado en la dieta, con posibles consecuencias para la salud de los peces y para la calidad nutricional del producto final (Tocher, 2010) . Por lo tanto, a través de una mejor comprensión de los mecanismos moleculares que controlan el metabolismo de lípidos en los peces de cultivo, se espera mejorar considerablemente la eficiencia y la sostenibilidad de la acuicultura (Leaver y col., 2008). En este sentido, estudios recientes realizados en trucha arcoíris sugieren que el perfil de ácidos grasos en el filete puede ser modificado por los horarios de alimentación y por el perfil de ácidos grasos de la dieta, lo que sugiere la existencia de patrones circadianos en la deposición de ácidos grasos en esta especie (Brown y col., 2010). Sin embargo, mientras que la regulación circadiana del metabolismo de lípidos y colesterol, así como los genes y las enzimas implicadas, ha sido demostrada en roedores (Le Martelot y col., 2009), no se conoce acerca de esta regulación en peces teleósteos. El objetivo principal del presente estudio fue investigar la relación entre la expresión diaria de los componentes claves del reloj biológico y los genes del metabolismo de lípidos, incluyendo los principales factores de transcripción y sus genes diana, en el hígado de salmón.

Metodología Alevines parr de salmón Atlántico (100 peces) fueron mantenidos en un estanque de 1000 L en el Instituto de Acuicultura (Stirling, Reino Unido) y aclimatados a un ciclo de fotoperíodo de día largo (16 h luz: 8 h oscuridad). El alimento se ofreció continuamente y a saciedad, durante el día y la noche, a través de un alimentador de banda mecánica accionada mediante mecanismos de reloj. Después de un mes, se obtuvieron muestras de tejido hepático de seis ejemplares cada 4 h, durante un período de 24 h. Se extrajo el ARN total y se sintetizó el ADNc, siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante (Applied Biosystems, Warrington, UK). Los genes reloj Bmal 1, Clock, Per1, Per2 y 1α Rev-erb; los genes del factor de transcripción asociados a los lípidos, Srebp1, Srebp2, Lxr, Pparα y Pparγ; y los genes dianas involucrados en las principales rutas del metabolismo de los lípidos, incluyendo la síntesis de ácidos grasos (Fas, D6Fad, D5Fad, Elovl5 y Elovl2), el catabolismo (Cpt1 y Aco) y metabolismo del colesterol (Hmgcr, Mev, Dhcr7, Ipi, Abca1 y Cyp71α) y, el metabolismo de las lipoproteínas (Apoa1, Apob, ApocII, Ldlr, El, Lpla, Lplb y Lplc), fueron analizados a través de PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR). El Análisis de Varianza (Anova) fue utilizado para determinar los efectos significativos del tiempo, mientras que para determinar las diferencias significativas entre el tiempo que se tomó la muestra y la media de los diferentes conjuntos de muestras, se usó la prueba de Tukey (InStat 3.1, GraphPad). Los datos se ajustaron a ondas cosinusoidales con el fin de determinar la presencia significativa de un ritmo diario. Los datos en bruto se analizaron utilizando el programa de análisis circadiano Acro (Universidad de Carolina del Sur, Estados Unidos; http://www.circadian.org/softwar.html).

Resultados

Expresión de genes reloj en el hígado De los cinco genes reloj investigados, todos se expresaron en el hígado, pero sólo Bmal 1 mostró un patrón de expresión diario significativo, cuando los resultados se ajustaron a una onda cosinusoidal utilizando el programa Acro (Fig 1; Tabla 1). La acrofase (el máximo punto alcanzado en el ciclo diario de expresión) de Bmal 1 ocurrió tres horas antes de apagar las luces al momento del Zeitgeber (ZT) 13:00 ± 3,9.

Expresión genética de los factores de transcripción De los genes relacionados con el metabolismo estudiado, los que pertenecen a los factores de transcripción presentaron una ritmicidad más consistente. Por lo tanto, cuatro de los cinco factores de transcripción estudiados presentaron patrones de expresión rítmicos de 24 h en el hígado de salmón Atlántico (Fig. 1; Tabla 1). Los genes Srebp1, Lxr, Pparα y Pparγ exhiben variaciones rítmicas significativas en la expresión de ARNm, mientras que Srebp2 no mostró tal tendencia (Fig. 2). Sin embargo, a diferencia de Srebp1, Pparα y Pparγ cuya expresión era rítmica, Lxr no presentó diferencias significativas temporales en los niveles de expresión. La acrofase de ciclos de expresión fue comparable para Lxr, Srebp1 y Pparα, pero avanzó 4 h para Pparγ (Tabla 1).

Expresión de genes de la homeostasis de lípidos y colesterol Los perfiles de expresión diarios de los genes del metabolismo de colesterol mostraron que sólo Ipi y Hmgcr expresan un ritmo diario significativo, que muestra la expresión máxima alrededor de ZT 09:00, siete horas antes de la fase de oscuridad (Fig. 3; Tabla 1). Mientras Dhcr7 y Cyp71a no mostraron un ritmo diario significante, sí se observaron diferencias significativas en la expresión entre los puntos de muestreo, alcanzando la máxima transcripción a ZT 22:00, al final de la fase de oscuridad (Fig. 2). Ninguno de los genes implicados en la síntesis de ácidos grasos o catabolismo muestra un perfil de expresión diario significativo, o diferencias significativas entre los puntos de muestreo (Fig. 4; Tabla 1). Los genes del metabolismo de lipoproteínas, ApoCII y El, siguieron una expresión rítmica, alcanzando su acrofase en ZT 10:00 y 22:00, respectivamente, aunque no hubo diferencias significativas temporales en los niveles de expresión (Fig. 3).

Discusión y conclusiones Existe evidencia de que el metabolismo de los peces es variable en el tiempo, de acuerdo con la influencia de estímulos exógenos y endógenos. Esto se ha propuesto, por ejemplo, para la digestibilidad de proteínas en tilapia (De Silva, 1985) y el metabolismo lipídico en bacalao murray y trucha arcoíris (Turchini y col., 2007; Francis y col., 2009; Brown y col., 2010). Sin embargo, no existe información acerca de los mecanismos moleculares implicados y cómo el núcleo del reloj endógeno central puede regular su transcripción. Los resultados del presente estudio demostraron, por primera vez, la regulación diaria de genes específicos del metabolismo de los lípidos en el hígado de salmón Atlántico, y se presentó una visión de los mecanismos de control molecular que estarían implicados. En este sentido, se caracterizó la expresión de cuatro genes reloj, Bmal1, Clock, Per 1 y Per 2, siendo Bmal1 el único que muestra un perfil diario de expresión significativo. Sin embargo, el perfil diario de expresión de Bmal1 identificado en este estudio, en ausencia de expresión rítmica adicional de otros genes circadianos, puede indicar una función adicional de Bmal1 en el hígado del salmón Atlántico. De modo, Bmal1 puede ser autoregulado por otros elementos de la ruta del metabolismo de los lípidos. Específicamente, se ha demostrado que Pparα controla la expresión de Bmal1 en el hígado (Canaple y col., 2006). Con respecto a la presente investigación, la expresión del ARNm de Bmal1 y Pparα en el hígado, parecía estar en fase con sus acrofases, lo que indica que la expresión y la regulación de estos genes podrían estar relacionadas, como en mamíferos. Uno de los hallazgos más interesantes de este estudio fue la fuerte ritmicidad mostrada por los factores de transcripción. De los 31 genes examinados en el presente estudio, 9 siguieron un patrón rítmico en el hígado de salmón Atlántico, los factores de transcripción representan el grupo más consistente (cuatro de cada cinco genes). Sin embargo, en los peces no está claro si la expresión de Ppar muestra una variación rítmica como se describe para los mamíferos (Yang y col., 2006) y, del mismo modo, la información obtenida en este estudio fue limitada, en cuanto a las fluctuaciones temporales de los genes implicados en el metabolismo lipídico sobre el ciclo diario LD. En el presente artículo, la diferencia en la acrofase podría estar correlacionada con las funciones conocidas de Ppars, con la expresión de α siendo alta en condiciones de baja alimentación, justo antes de la escotofase, mientras que la expresión de γ fue mayor cuando los niveles de lípidos fueron altos en la mitad de la fase de luz. Es importante señalar que los salmónidos son depredadores visuales, por lo tanto, se espera una disminución en el consumo de alimento en la escotofase. Del mismo modo, la expresión rítmica observada en El y ApoCII, dos genes implicados en el metabolismo de las lipoproteínas, pareciera estar vinculado con la disponibilidad de los lípidos. Por lo tanto, se observó un aumento en la expresión de El durante la fase oscura, período cuando la alimentación es baja y se requiere de la liberación de los lípidos de las lipoproteínas. En contraste, ApoCII, que es importante en la formación de lipoproteínas de muy baja densidad, es mayor en el medio de la fase de luz, cuando es mayor la alimentación y, por lo tanto, aumentan los niveles de lípidos plasmáticos que promueven la producción de lipoproteína hepática. Los controladores físicos de la expresión rítmica en ambos genes circadianos, así como en el metabolismo de lípidos no se habían determinado, sin embargo, es probable que sea el fotoperiodo, la disponibilidad de alimentos o una interacción de ambos, lo que controla los patrones de expresión observados. En tanto, el aumento de la transcripción de Lxr podría estar relacionado con el ritmo diario de la biosíntesis de colesterol en el hígado de salmón, mostrando una mayor producción de novo durante la fase oscura, cuando hay un estado de ayuno, como ha sido reportado para los seres humanos (Jones y Schoeller, 1990). Contrario a lo que sucede en mamíferos, en el salmón Atlántico los mecanismos implicados en la conversión de colesterol en ácidos biliares no parece estar bajo la regulación diaria a través de REV-ERB 1α. Esto sugiere que la regulación puede ser a nivel de proteínas, a una diferencia del nivel transcripcional o a una vía diferencial como se describió previamente en los mamíferos. Isopentenyl isomerasa difosfato (IPI), una enzima presente en la síntesis de colesterol que cataliza la conversión de pirofosfato de mevalonato a pirofosfato de farnesilo, muestra una expresión rítmica. Esta enzima no siguió la tendencia observada por Srebps, Lxr o Cyp71a, pero debe tenerse en cuenta que cada una de las etapas de síntesis está bajo una rígida regulación a través de una retroalimentación negativa de algunos sustratos intermedios y no sólo por el producto final, el colesterol. Esto también podría explicar por qué otros genes del metabolismo del colesterol Mev y Dhcr7 muestran diferentes perfiles de expresión, en función de la etapa que se esté suscitando en ese momento. En conclusión, el presente estudio ha proporcionado la primera evidencia de la expresión diaria de genes implicados en la homeostasis de colesterol y de lípidos en el hígado de salmón Atlántico bajo un ciclo LD. Los factores de transcripción parecen presentar una expresión rítmica fuerte, lo que podría indicar su papel como sincronizadores. Sin embargo, la expresión de algunos genes diana no mostró una expresión significativa diaria, lo que indica que esta vía de activación puede diferir entre los mamíferos y peces teleósteos o que otros factores de arrastre pueden regular su expresión en el hígado. Estos resultados proporcionan la base para la comprensión del papel del reloj circadiano en la regulación del metabolismo de los lípidos en peces teleósteos. Para el futuro, esperamos, a través de una investigación que se encuentra en curso, examinar en mayor profundidad la interacción de los relojes, el metabolismo de lípidos y en última instancia, su reordenamiento por ambiente y/o las prácticas de alimentación en salmón Atlántico. Creemos que ésta área de investigación podría ser un enfoque novedoso y la clave para mejorar la acuicultura de salmónidos mediante la optimización de protocolos de alimentación y/o las condiciones ambientales para que coincida con los ritmos del metabolismo de los lípidos en peces. Para más información sobre éstas y otras investigaciones relacionadas de los autores pueden comunicarse a mbbetancor@stir.ac.uk o andrew.davie@stir.ac.uk Este trabajo se realizó en el Instituto de Acuicultura (Universidad de Stirling) clasificado como uno de los mejores departamentos de formación para la investigación en acuicultura en el Reino Unido. Más detalles en www.aqua.stir.ac.uk

Referencias Brown, TD, Francis, DS and Turchini GM (2010) Can dietary lipid source circadian alternation improve omega-3 deposition in rainbow trout? Aquaculture 300, 148-155. Canaple L, Rambaud J, Dkhissi-Benyahya O, Rayet B, Tan NS (2006) Reciprocal regulation of brain and muscle arnt-like protein 1 and peroxisome proliferator- activated receptor alpha defines a novel positive feedback loop in the rodent liver circadian clock. Mol Endocrinol 20, 1715-1727. Davie A, Minghetti M, Migaud H (2009) Seasonal variations in clock-gene expression in Atlantic salmon (Salmo salar). Chronobiol Int 26, 379-395. Francis DS, Turchini GM. Smith BK, Ryan SG and De Silva SS (2009) Effects of alternate phases of fish oil and vegetable oil based diets in Murray cod. Aquac Res 40, 1123-1134. Jones PJH, Schoeller DA (1990) Evidence for diurnal periodicity in human cholesterol synthesis. J Lipid Res 31, 667-673. Migaud, H., Davie, A., & Taylor, J. F. (2010). Current knowledge on the photoneuroendocrine regulation of reproduction in temperate fish species. Journal of Fish Biology, 76(1), 27-68. Turchini GM, Francis DS and De Silva (2007) Finishing diets stimulate compensatory growth: results of a study on Murray cod, Maccullochella peelii peelii. Aquacult. Nutr. 13, 352-360. Yang X, Downes M, Yu RT, Bookout AL, He W, y col.,. (2006) Nuclear receptor expression links the circadian clock to metabolism. Cell 126: 801-810.