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Renibacterium salmoninarum y sus mecanismos de virulencia: El nuevo desafío de la salmonicultura chilena

Presencia de gran
cantidad de nódulos a
nivel renal (Gentileza
Matías Poblete-Morales).
Presencia de gran cantidad de nódulos a nivel renal (Gentileza Matías Poblete-Morales).

Jörn Bethke1,2, Alejandro Yáñez2,3 & Ruben Avendaño-Herrera1,2
1Laboratorio de Patología de Organismos Acuáticos y Biotecnología Acuícola, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Andrés Bello. 2 Interdisciplinary Center for Aquaculture Research, Fondap Incar. 3 Instituto de Bioquímica y microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile.

La industria acuícola chilena ha crecido exponencialmente durante los últimos 20 años, posicionando al país como el mayor productor de trucha arcoíris (Oncorhychus mykiss) y salmón Coho (Oncorhychus kisutch) y el segundo mas grande en la producción de salmón Atlántico (Salmo salar) a nivel mundial. Esto queda reflejado con los datos obtenidos de la cosecha de salmónidos en 2013, que presentó un aumento de 23% en relación con la producción del año 2011, con 804.000 toneladas. Sin embargo, una consecuencia directa del aumento en la producción de salmones es la disminución de las condiciones sanitarias, lo que aumenta el riesgo de los peces a contraer infecciones bacterianas. Una de estas bacterias es Renibacterium salmoninarum, el agente responsable de la Enfermedad Bacteriana del Riñón (BKD, por sus siglas en inglés), siendo una de las patologías de mayor impacto para la industria de salmónidos chilenos. Esta enfermedad es responsable a nivel mundial de pérdidas directas debido a las mortalidades que provoca y a la disminución en el crecimiento de peces crónicamente infectados (Bruno, 1986b; Evelyn, 1988), siendo el salmón Atlántico la especie más susceptible. Además, R salmoninarum también es responsable de una pérdida significativa de poblaciones de peces silvestres (Elliott y col., 1989; Jónsdóttir y col., 1998; Kent y col., 1998).

En Chile, el Programa de Vigilancia Pasiva, una iniciativa coordinada por el Servicio Nacional de Pesca y Acuicultura, en el cual los laboratorios de diagnósticos privados deben reportar todos los diagnósticos generados y sus respectivos agentes causales; denotan en 2013 una incidencia del 21,3% de este patógeno intracelular. Así, los diagnóstico de laboratorios revelan una ocurrencia de 245 diagnósticos positivos de los 1.150 diagnósticos totales (www.sernapesca.cl), mostrando un incremento de 9,98% en comparación con el año 2012. Además, es importante considerar que R. salmoninarum no tiene un Programa Sanitario Específico de Vigilancia y Control (PSEVC), por lo tanto, no todos los casos de BKD son enviados para su análisis de laboratorio, por lo que su incidencia podría ser infravalorada o sólo asociada con los brotes más graves. A través de un análisis detallado de los datos del 2013, en salmón Atlántico la incidencia fue del 72,6%, en salmón Coho del 24,5%, y en trucha arcoíris del 2,9%.

Renibacterium salmoninarum es una bacteria Gram-positiva, diplo-bacilo, no móvil, que no forma esporas ni es ácido-alcohol resistente, con carácter intracelular y de crecimiento lento (más de 20 días). Actualmente, éste es el segundo patógeno con mayor impacto y prevalencia en la industria acuícola en Chile, especialmente en la Región de Magallanes y de la Antártica Chilena, debido a las condiciones de temperatura que no son favorables para otro tipo de patógenos. Típicamente, en peces R. salmoninarum causa una infección sistémica, lenta y progresiva, la cual raramente manifiesta signos clínicos. Incluso en peces con una grave infección, éstos podrían carecer de síntomas externos o manifestar signos que no son especie-específicos, tales como letargo, oscurecimiento externo, exoftalmia, branquias pálidas y petequias hemorrágicas (principalmente, en la línea lateral y base de aletas). Internamente, se puede observar el engrosamiento del y lesiones granulomatosas de color blanco-grisáceas y, a veces, en el bazo e hígado. Además, en algunos casos se ha observado una membrana que encapsula el riñón, bazo, corazón y otros órganos (Bruno 1986a).

El BKD es una enfermedad que puede ser transmitida verticalmente, mediante los huevos de padres infectados (Evelyn y col., 1986a; Evelyn y col., 1986b); y horizontalmente, debido a que R. salmoninarum puede sobrevivir en agua dulce o agua de mar por un tiempo limitado, pero suficiente como para asegurar la transmisión horizontal (Evelyn, 1988). También la enfermedad puede transmitirse por cohabitación con peces infectados, a través de sedimentos (Austin & Rayment, 1985) o vía fecal-oral (Balfry y col., 1996). Además, existen otros factores importantes que pueden facilitar la transmisión horizontal, incluyendo el marcaje de peces con Wire-targgeting debido a que las heridas que se producen favorecen la infección (Elliot & Pascho, 2001).

Precisamente, esta capacidad de transmisión vertical y horizontal provoca que R. salmoninarum sea muy persistente, dificultando de sobremanera su control. Así, para contrarrestar el BKD, las empresas productoras de salmones emplean una gran cantidad de antibióticos debido a la falta de vacunas efectivas contra este patógeno. Actualmente, en el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) de Chile sólo existe una vacuna comercial registrada, pero debido a su baja cobertura y escasa disponibilidad, durante el año 2014 el SAG autorizó el uso de autovacunas.

En Chile, la presencia de R. salmoninarum se remonta a más de 20 años, sin embargo, a la fecha son escasos los estudios sobre las características bioquímicas, genéticas y serológicas de los aislados chilenos. No obstante, en el último año se han abordado algunos de estos tópicos por una empresa farmacéutica, pero poco se conoce sobre los mecanismos de virulencia de la población nacional, los cuales son esenciales para comprender el proceso infectivo y detectar potenciales componentes candidatos para el desarrollo de futuras vacunas y de terapias efectivas alternativas al uso de antibióticos, que permitan el control y la mitigación del BKD.

A través del Proyecto de Investigación Fondecyt Regular Nº 1150695 “Identification and characterization of the iron uptake system in different Chilean Renibacterium salmoninarum isolates and its influence on pathogenesis and inmunogenicity in Atlantic salmon and rainbow trout”, se profundizará en los mecanismos de patogenicidad de aislados chilenos del patógeno. Hasta ahora, estudios sugieren una acción sinérgica entre toxinas y enzimas presentes en productos extracelulares (PEC) incluyendo hemolisinas, catalasas, proteasas, DNAsas (Bruno & Munro, 1982; 1986), exotoxinas (Shieh, 1988) así como hierro reductasas (Grayson y col., 1995). Otros factores de virulencia putativos asociados con la superficie celular de R. salmoninarum también han sido examinados. Estudios indican claramente que las células R. salmoninarum poseen una capa de material capsular cuyo espesor varía entre 30 a 60 nm (Dubreuil y col., 1990a). Del mismo modo, la microscopía electrónica ha revelado fimbrias flexibles de menos de 2 nm de diámetro (Dubreuil y col., 1990b) que son responsables de la actividad hemaglutinante y el aumento de la hidrofobicidad de las células del patógeno, lo que permite el contacto con los macrófagos.

Cabe señalar que la complejidad del crecimiento de R. salmoninarum en condiciones de laboratorio ha originado inconsistencias en las conclusiones sobre la actividad de algunos de los componentes de virulencia señalados previamente. Por ejemplo, Wiens (2011) indica que no hay ninguna prueba concluyente de la contribución de las enzimas extracelulares o la cápsula. De hecho, hay incluso opinión divergente en cuanto a la presencia de actividad biológica en los PEC de R. salmoninarum. Bandín y col., (1991) describieron que los PEC de un grupo de aislados de diferentes orígenes geográficos tuvo una baja producción de proteínas extracelulares y no se observó actividad hemolítica ni capacidad de alterar el equilibrio osmótico de los eritrocitos de peces. Además, ninguna de las muestras de PEC presentó actividad citotóxica, independientemente del origen de la línea celular examinada, ni contenían sustancias letales para los peces. Sin embargo, en otras investigaciones, proteasas (Sakai y col., 1989) y hemolisinas (Grayson y col., 2001) han sido detectadas.

En el entorno natural, un primer requisito para la colonización exitosa de un tejido en el hospedero es la capacidad de adherirse, lo que puede ocurrir de una forma específica o no específica (Ofek & Doyle, 1994). Daly & Stevenson (1987), estudiaron 25 aislados de diferentes localizaciones geográficas, observando que R. salmoninarum posee una superficie celular hidrófoba debido a la presencia de una hemaglutinina proteica (Daly & Stevenson, 1989; Daly & Stevenson, 1990). Esta proteína se retiró de la superficie celular mediante el lavado de las bacterias con agua destilada, y se encontró que tenía una masa molecular de 57 kDa. Aunque la hidrofobicidad y autoagregación han sido relacionadas con la virulencia de R. salmoninarum (Bruno DW, 1988), en la actualidad, la proteína más caracterizada es la proteína 57/58 kDa (p57).

Esta proteína estable al calor es abundante en la superficie celular bacteriana, pero también se secreta en grandes cantidades como un monómero, tanto al medio de cultivos líquidos como en peces infectados (Wiens, 1999). De hecho, estudios previos realizados por Barton y col. (1997) donde caracterizó el PEC de una cepa canadiense y encontró que las proteínas extracelulares estaban compuestas prácticamente en su totalidad por la proteína p57 y material soluble tipo polisacárido similar a O-polisacarido. Posteriormente, Wiens & Dale (2009) observaron que esta proteína es común para todos los aislados. Además, se han detectado derivados de la degradación y agregación de la misma proteína en tejido de peces infectados, siendo importantes para la aglutinación de leucocitos de salmónidos (Senson & Stevenson, 1999; Wiens, 1999).

La proteína p57 es el principal mediador en la supresión de la inmunidad, reduciendo la producción de anticuerpos e interviniendo en la actividad de citoquinas (Fredriksen y col., 1997). Se encuentra codificada por los genes msa [major soluble antigen], msa1, msa2 y msa3 (duplicado de msa1 no esta presente en todos los aislados) (Rhodes y col., 2002, 2004). Los dos genes msa1 y msa2 son necesarios para una virulencia completa (Coday y col., 2006). Es interesante señalar que al preincubar R. salmoninarum a 37 ºC por al menos 4 horas, se detecta una disminución de su hidrofobicidad y menor cantidad de p57 asociada a la célula. Sin embargo, al incubar la bacteria con los PEC, p57 se reasocia en la superficie de la bacteria recuperando la hidrofobicidad (Piagnelli y col., 1999). Por otra parte, se ha demostrado en el aislado noruego 684, que la sustitución de un único aminoácido alanina por glutamina en la región amino terminal de la proteína, resulta en un aumento de la adhesión a leucocitos de salmón Chinook (Wiens, 2002). También existe evidencia que R. salmoninarum puede ser internalizada tanto por células no fagocíticas (Gonzalez y col., 1999), como macrófagos dentro de los cuales la bacteria puede sobrevivir por diez o más días, en donde el microorganismo presenta bajo índice de crecimiento y división (Young & Chapman, 1978, Gutenberger y col., 1997), pero continua produciendo factores putativos de virulencia (McIntosh y col., 1997).

Para estudiar los mecanismos de internalización de R. salmoninarum en condiciones in vitro, González y col., (1999) utilizaron las líneas CHSE-214 y RTG-2 acopladas con iFAT, demostrando que células bacterianas son capaces de ingresar a las células y se localizan en vacuolas, incluso también en el citoplasma. En peces infectados, se ha observado que son capaces de responder al proceso patogénico de R. salmoninarum produciendo factores de estrés como cortisol plasmático y lactato, reduciendo los niveles de glucosa en el plasma (Mesa y col., 1999). Además, Forsyth y col., (1997) reconocieron en salmón Coho infectado una proteína de estrés HSP70.

En base a lo descrito anteriormente, el conocimiento existente respecto de la virulencia de R. salmoninarum ha sido realizado con aislados de locaciones geográficas distintas a aquellos que predominan en Chile. Además, los estudios han sido focalizados en p57 y esperamos que la ejecución e nuestro proyecto Fondecyt Regular Nº 1150695 permita generar conocimiento asociado con otros mecanismos de virulencia distintos a los ya mencionados, para esclarecer los mecanismos de interacción que existen entre la bacteria y su hospedero, pudiendo así desarrollar en un futuro nuevas terapias que permitan controlar la enfermedad de manera mas efectiva y amigable, disminuyendo o eliminando el uso de antibióticos para controlar BKD.

 

Agradecimientos:

Fondecyt Regular Nº 1150695 y Fondap 15110027

Referencias

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