Seguimiento inmunológico de salmónidos aplicado a SRS
Iván Tobar, Sergio Arancibia, Verónica Vera, Claudia Carrasco, Constanza Torres y Jaime A. Tobar*. Centrovet Ltda. Avenida Los Cerrillos #602, Cerrillos, Santiago. *Autor principal. e-mail: jaime.tobar@centrovet.com
Resumen
Actualmente, existe un creciente interés por determinar el perfil inmunológico y el estado protectivo de los salmónidos vacu- nados, con el fin de evitar brotes infecciosos. Desde hace 5 años, hemos iniciado un programa de seguimiento inmunológico de todos los centros acuícolas que utilizan vacunas de Centrovet. Este proyecto tiene como objetivo correlacionar datos epide- miológicos y el perfil inmune de los peces vacunados, con el nivel de protección a lo largo de todo el ciclo productivo. Para esto, se ha creado una base de datos que agrupa los resultados de las distintas variables ana- lizadas, dentro de las que se destacan los niveles de IgM específicos anti-patógeno, permitiéndonos evaluar la potencia y eficacia de las vacunas administradas en terreno. La investigación que se realiza pretende ampliar el conocimiento de la inmunidad de los salmónidos para crear un modelo predictivo que ayude a la toma de decisiones en los programas de vacunación de los centros de cultivo. Los resultados obtenidos a la fecha nos han permitido establecer una comunicación efectiva con los centros de cultivo para minimizar los potenciales problemas y optimizar los programas de vacunación futuros.
Introducción
La producción comercial de salmónidos en Chile ha sido un importante aporte al crecimiento del país. Para continuar con la capacidad e intensidad de producción de peces por año, es de crucial importancia mantener controlados los riesgos que amenazan la salud y rendimiento de los salmónidos. Es por esto que la oportunidad y necesidad de desarrollar investigación para crear modelos que ayuden a predecir po- sibles problemas, comprender y/o ayudar a la mejora de procesos productivos en los centros de cultivo de salmónidos, se torna fundamental. Recientemente, varias publicaciones han aportado al entendimiento de la respuesta inmune de los salmónidos, demostrando que existe una correlación entre niveles de protección de anticuerpos contra el virus de la Anemia Infecciosa del Salmón (ISA) y Piscirickettsia salmonis (SRS). En estudios independientes, técnicas de in- munoensayo han logrado cuantificar la po- tencia y eficacia de vacunas administradas a peces, determinando lo importante que ayuda a la protección y salud de los salmó- nidos (Lauscher et al. 2011; Wilda et al. 2012). Además, han surgido estudios retrospectivos de años de duración, que han permitido examinar y analizar distintos componentes para poder encontrar corre- laciones lineares, que ayuden a encontrar variables predictivas de importancia en el bienestar de los peces (Kristensen et al., 2012). Para continuar con la búsqueda de nuevos modelos que ayuden a mejorar las estrategias en la producción de cultivo de salmónidos, nos propusimos evaluar en terreno la respuesta inmune de los peces vacunados, además de la evaluación delestatus de infección en los mismos. Esto nos permitió generar un diagrama de los distintos factores que predisponen a brotes, conocer acerca de la mejor forma para minimizar los potenciales problemas, y además optimizar los programas de vacunación futuros. Para lograrlo, se ha creado una base de datos que se incrementa cada día con la acumulación de resultados que se obtienen de los análisis de muestras de órganos y sueros recibidos de muestreos realizados a peces pre y post vacunados en centros de cultivo de pisciculturas, estuarios y centros de mar de empresas salmonicultoraschilenas(Fig.1).Aestasempresas se les monitorea y evalúa el estado de los peces pre y post vacunación, gracias a vi- sitas periódicas por personal técnico espe- cializado. De esta manera, se pueda tener registro del estado inmunológico de los salmónidos a lo largo de su crecimiento y así poder medir sus niveles de anticuerpo, para dar aviso de cuándo los títulos alcan- zados en el último muestreo realizado se acercanalnivelderiesgo.Conestabase
de datos se ha podido realizar correlaciones entre distintas variables: tipo de centro de cultivo, especie, portación, vacunas, booster, UTAs, concentración de IgM, niveles protectivos y umbral de riesgo. Este estudio, pionero en la industria salmonicultora chi- lena, ha permitido ayudar a la optimización de los programas de vacunación.
Materiales y Métodos
Peces. Se utilizaron muestras de suero de peces vacunados provenientes de 257 centros de acuicultura, dentro de los cuales 115 de ellos cultivan Salmo salar, 88 Oncorhynchus mykiss y 54 Oncorhynchus kisutch. Los peces fueron mantenidos de acuerdo con las disposiciones establecidas por cada cen- tro de cultivo, y sometidos a los factores ambientales propios de cada región geo- gráfica.
Vacunación. La vacunación inicial o primo-vacunación fue administrada en peces de piscicultura a través de la inyección intraperitoneal de una emulsión oleosa que contiene el antígeno SRS inactivado, fabricada por diferentes laboratorios veterinarios. Adicionalmente, se incorporó al estudio grupos de peces que fueron sometidos a una vacunación de refuerzo o booster durante su ciclo productivo, utilizando una vacuna SRS Oral (Centrovet Ltda). Esta formulación fue administrada en la etapa de engorda del pez y contiene el antígeno SRS inactivado y encapsulado en una matriz propiedad de la empresa Advanced BioNutrition Corporation (ABN). Ambas vacunas fueron administradas de acuerdo a las especificaciones establecidas por el proveedor.
Purificación de IgM. Salmones del Atlántico de 30-50g, sanos y no vacunados, fueron obtenidos desde un centro de acuicultura local y mantenidos en el laboratorio en una densidad de 15 kg/m3 en estanques de 0,1 m3. Para obtener la inmunoglobulina M (IgM), los peces fueros anestesiados en una solución acuosa de benzocaína al 0,001% p/p y sangrados por la vena caudal. Las muestras de sangre fueron dejadas toda la noche a 4 °C, luego centrifugadas por 2 min a 8000 rpm. Las proteínas del suero fueron colectadas, dializadas contra PBS estéril y mantenidas a -20 °C. La IgM fue separada y purificada por cromatografía de exclusión molecular y HPLC. Finalmente, la IgM purificada, fue utilizada en una curva estándar para la cuantificación de IgM específicas anti-SRS. Cuantificación de anticuerpos por ELISA. Se activaron placas de ELISA con el antígeno de P. salmonis en buffer bicarbonato, pH 8,5. Las placas se bloquearon e incubaron con muestras de suero provenientes de los peces vacunados. Posteriormente, la placa se lavó e incubó con un anticuerpo monoclonal anti-IgM de salmón a 37 C. Después de esta incubación, la placa se volvió a lavar, y se incubó con un anticuerpo IgG anti-mouse conjugado a la enzima peroxidasa. Finalmente, la placa se lavó y la presencia de anticuerpos se reveló mediante la adición del sustrato TMB. La concentración de IgM de cada suero se determinó a través de una curva estándar utilizando la IgM purificada. La muestra fue leída a 450 nm en un lector de placas de ELISA (Asys Expert Plus – Biochrom, UK). Estadística. La comparación entre grupos fue realizada mediante ANOVA de una vía – Dunnett post test. Las diferencias estadísticas fueron definidas con un valor de p menor que 0,05. El análisis fue realizado con el programa GraphPad Prism (USA).
Resultados El programa de seguimiento inmunológico de vacunas, comenzó el año 2008 y ha ido creciendo a lo largo de los años (Fig. 2) proyectando unos 1.000 seguimientos para finales del año 2013. Las especies analizadas han sido en mayor proporción salmón Atlántico, luego truchas y cohos (Fig. 3). Para cuantificar los niveles de anticuerpos séricos presentes en los peces vacunados, la proteína IgM del salmon Atlántico fue purificada con el propósito de generar un test de ELISA cuantitativo. Esta técnica inmuno-química nos permitió asociar el nivel de anticuerpos específicos anti-P. salmonis con el grado de protección que promueven las vacunas inyectables y orales para SRS. Los resultados revelan que las muestras de sueros de peces inmunizados con vacunas comerciales inyectables presentan un alto nivel de anticuerpos específicos anti-P. salmonis, alcanzando una máxima concentración alrededor de las 800 UTAs post vacunación. Sin embargo, el grado del título de anticuerpos conferido por la primo-vacunación disminuye fuertemente a partir de las 1.800 UTA, aunque sin alcanzar a llegar a niveles similares a los de un pez no vacunado (Fig. 4). De acuerdo con estos resultados, se estableció un periodo de tiempo entre 1.700 y 1.900 UTA post vacunación, en el cual los centros de cultivo puedan iniciar una segunda inmunización, esta vez por vía oral, para mantener un alto nivel de anticuerpos. Esta estrategia ha sido apoyada por diversos estudios previos, que han indicado que la vacunación oral es el método más ventajoso como inmunización de refuerzo en el estado de engorda de los peces (Bowden et al., 2002; Romalde et al., 2004). Alrededor de las 1.700 UTA, los peces fueron vacunados por 10 días consecutivos por la vía oral, de acuerdo con las especificaciones del producto. Posterior a esta segunda inmunización, la concentración de IgM aumentó significativamente en comparación con el control. Sin embargo, y al igual que la primera vacunación, la ventana de inmunidad se mantuvo sólo por un periodo de 3 meses (Fig. 4). Previamente, nosotros y otros grupos
han demostrado que una baja concentra- ción de anticuerpos en la sangre aumenta el riesgo de contraer SRS (Tobar et al., 2011, Wilda et al., 2012). En este contexto, suce- sivas inmunizaciones serán requeridas para proteger al salmónido a lo largo de todo su ciclo productivo, en forma proporcional al tiempo de cultivo en fase de engorda. Un ejemplo de esto, es la aplicación de una tercera inmunización (segunda de tipo oral), aplicada entre 2.800 y 3.000 UTA, la cual fue administrada para evitar que la concentración de anticuerpos disminuyera a un rango considerado como riesgoso. Nuevamente, los peces vacunados aumen- taron la concentración de IgM sérica alcan- zando un máximo entre las 3.200 y 3.400
UTA, donde comienzan a decaer.
Discusión
El estudio de la respuesta inmune de los peces ha sido y continúa siendo un área de particular interés en acuicultura, especialmente respecto de especies cultivadas a gran escala y sometidas a manejos con im- pacto inmunológico, como la aplicación de vacunas y productos inmunoestimulantes. En el caso de la salmonicultura, ésta no es la excepción, y la necesidad de tener indicadores de protección se hace imperiosa no sólo a nivel científico, sino también a nivel productivo, con el fin de disminuir la razón costo/beneficio que significa la vacunación masiva de una partida de producción. Entre las principales dificultades para hacer de este proceso una realidad, está la poca disponibilidad de herramientas validadas y específicas para ponderar pará- metros del sistema inmune de los peces, lo que está actualmente en promisorio desarrollo por organizaciones nacionales y extranjeras. Con el fin de disponer de una herramienta rápida y con potencial informativo, tomamos como principal parámetro el seguimiento de los niveles de IgM por medio de ELISA, dado que existen productos comerciales bien conocidos y validados para evaluar su abundancia en el suero de peces. Con el fin de desarrollar este estudio, se generó un complejo sistema de visitas técnicas a los centros de cultivo, y gestión de envío de muestras en condiciones óptimas, para poder analizar con certeza los niveles de anticuerpos específicos (Fig. 1). Para al presente análisis se tomaron poblaciones históricas de peces cultivados, de diferentes especies, en cantidades crecientes desde el año 2012 (Fig. 2 y 3). Los análisis de ELISA de IgM anti-P. salmonis muestran coherencia con la noción de que las vacunas inyectables no entregan protección durante todo el ciclo productivo, pues si bien la curva presenta un aumento considerable y significativo (Fig. 4), posterior a las 1.600 UTA post vacunación comienza a decaer a niveles cercanos a los basales, los que usualmente están entre las 1.800 y 2.000 UTA post vacunación. Adicionalmente, la entrega de boosters orales ayuda a inducir anticuerpos específicos nuevamente, que son significativamente mayores comparados con los niveles observados al momento de vacunar, sugiriendo una mejora y aumento en los niveles de protección (Fig. 4). Si bien la correlación de la protección frente a P. salmonis es un tema en discusión en la industria nacio- nal, estudios recientes que buscan validar valores de RPS con títulos de anticuerpos han reforzado esta hipótesis, encontrando una alta correlación entre el título de anticuerpos que induzca una determinada va- cuna, y el nivel de protección de la misma (Wilda et al., 2012). Dados los resultados anteriormente ex- puestos, y el potencial de esta herramienta como parte de un plan sanitario integral contra SRS, nuestro equipo postula que es posible prolongar los niveles protecti- vos de anticuerpos hasta el momento de cosechar a los salmónidos, con el fin de poder tener un mayor rendimiento en la producción, al evitar las enfermedades que disminuyen su calidad. A partir de la acumulación de resultados, se ha podido establecer rangos de niveles de anticuerpo IgM post primo-vacunación y post booster, entre distintas especies de salmónidos, frente a distintos patógenos y distintas vacunas administradas, estableciendo además regiones de riesgo o susceptibilidad a enfermedades, que se ven atenuadas o anuladas al mantener un plan de vacunación integral (Fig. 5). Esta herramienta, complementaria a futuros desarrollos, tales como la identificación y detección de poblaciones linfocitarias, perfil de citoquinas, polarización de respuesta celular y determinación de isotipos adicionales de inmunoglobulinas, como IgT, permitirán sin duda, mejorar las actuales condiciones sanitarias, y tomar mejores decisiones en términos producti- vos.
