Enfermedad y avances en el conocimiento de la resistencia genética en el salmón

Phillip Dettleff1 y Víctor Martínez2 1DVM, Dr. (c) en Cs. Silvoagropecuarias y Veterinarias. U de Chile. Laboratorio Favet-Inbiogen, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile. 2DVM, MSc, PhD en Genética Animal. Universidad de Edimburgo. Laboratorio Favet-Inbiogen, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile.

Introducción El síndrome rickettsial de salmón o SRS es la enfermedad bacteriana que históricamente ha causado las mayores pérdidas en la producción de especies salmonídeas en el país desde 1989[1], año en que fue descrita por primera vez en el sur de Chile en un ejemplar de salmón Coho [2]. Esta patología es causada por la bacteria intracelular facultativa Piscirickettsia salmonis [2, 3], la cual genera una enfermedad sistémica en el salmón, que puede manifestarse con diversas presentaciones clínicas, que suelen aparecer de seis a doce semanas luego de la transferencia al mar. Sin embargo, se ha observado que la infección puede estar presente en peces en la etapa de agua dulce sin manifestar la enfermedad [4]. Dentro de los signos se encuentras lesiones cutáneas, esplenomegalia, ascitis y hemorragia visceral, de vejiga natatoria, estómago y músculo, inflamación de hígado y riñón, branquias pálidas producto de una importante anemia causada por la bacteria [1, 3, 5, 6]. Dentro de las presentaciones clínicas se han descrito presentación cutánea, muscular, visceral, gastrointestinal, cerebral y cardíaca. La transmisión de la bacteria es vía horizontal, infectando incluso a través de piel y branquias intactas, aunque lesiones de piel facilitan su entrada [7], debido a lo cual la presencia de Caligus en los peces favorecería su diseminación, representando un posible factor de riesgo. La bacteria ha sido detectada en múltiples especies de salmónidos, incluyendo Salmón Atlántico (Salmo salar)[8-10], Trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) [11, 12], Salmón Coho (Oncorhynchus kisutch) [2], Salmón chinook (Oncorhynchus tshawytscha) [13] y Salmón rosado (Oncorhynchus gorbuscha) [13]. Adicionalmente, la bacteria también se ha presentado en otras especies no salmonídeas como Tilapia (Oreochromis mossambicus y Sarotherodon melanotheron) [14], Lubina blanca (Atractoscion nobilis) [15] y Lubina negra (Dicentrarchus labrax) [16]. No obstante, es en los salmónidos donde genera el mayor impacto. En este sentido, considerando los datos del programa de control de SRS, la especie que presenta un mayor número de centros de alta diseminación es el salmón Atlántico, seguida de trucha arcoíris y salmón coho (Figura 1). Esta información es concordante con el número de centros cultivados para salmón Atlántico, pero no así para trucha arcoíris que presenta una proporción superior de centros afectados en relación al número total de centros para esta especie. Con respecto a la distribución por etapa productiva de estos centros, más del 50% se encuentran en la etapa 3 de producción, correspondiente a peces sobre 3 kg. para salmón Atlántico, y sobre 2 kg. para trucha arcoíris y salmón coho. Respecto del porcentaje de mortalidad de SRS, la trucha arcoíris es la especie que se reporta con el mayor porcentaje de mortalidades por esta enfermedad, seguida de salmón Atlántico y salmón coho (Sernapesca, 2014).

Además de presentarse en Chile, Piscirickettsia salmonis se ha identificado en diversos países alrededor del mundo (Figura 2), incluyendo Irlanda [17], Noruega [18], Estados Unidos [19], Canadá [8], Escocia [20]. No obstante lo anterior, el SRS representa un problema productivo principalmente en Chile, siendo uno de los principales desafíos para la industria nacional. Estrategias de control Desde la aparición de esta enfermedad, diversas estrategias de control se han desarrollado con el fin de controlarla. La vacunación ha sido una de las estrategias ampliamente utilizadas, generándose diversas formulaciones con resultados promisorios en ensayos clínicos [21-23]. A pesar de la mejora en las formulaciones y avance en los resultados de protección, SRS continúa representando un problema aún en poblaciones vacunadas, probablemente relacionado con el efecto variable a largo plazo que han presentado [24], junto con la reducción en eficacia y aumento de mortalidad entre 10 a 12 semanas luego del traspaso al mar [25], siendo necesario la aplicación de dos booster para mantener niveles adecuados de anticuerpos durante toda la etapa de engorda, aunque esto no ha sido medido en términos prácticos, de forma tal de entender el rol protector de las vacunaciones. Otra estrategia de control de amplio uso que se ha utilizado para combatir esta enfermedad ha sido el uso de antimicrobianos [12], tales como el florfenicol y la oxitetraciclina. Sin embargo, el tratamiento puede presentar una eficacia variable, probablemente influenciado por la condición de intracelular facultativo de esta bacteria [1]. Otras prácticas que han probado ser de utilidad para prevenir brotes de SRS incluyen mantener baja densidad de peces y utilizar periodos de descanso. En este sentido se ha determinado que un período de descanso adecuado luego de remover los de peces es de 50 días [26]. Dentro de este marco, el Programa Específico de Vigilancia y Control de Piscirickettsiosis, aprobado el 2013, se ha enfocado en disminuir los brotes de SRS, a través de la detección temprana de los casos positivos y seguimiento de los mismos por medio de vigilancia de laboratorio y clínica patológica. Adicionalmente, el programa establece la aplicación de medidas de control graduales acorde al grado de avance de la enfermedad dentro del centro de cultivo, con el fin de evitar la diseminación de la misma, llegando incluso a la cosecha o eliminación de las jaulas afectadas. En este sentido, el SRS se ha planteado como uno de los principales desafíos para el año 2015 por parte de la autoridad de Sernapesca. Considerando que los tratamientos antimicrobianos y las vacunas no han tenido el éxito esperado en la práctica, la selección genética es una estrategia que permitirá el desarrollo de ovas genéticamente mejoradas, para una mayor sustentabilidad de la producción de salmónidos a nivel nacional. Ello, considerando las relativamente altas heredabilidades obtenidas para la resistencia a esta bacteria y el gran impacto de las ovas IPN resistentes, comercializadas por la empresa Aquagen en Chile.

Desarrollo de producción de ovas resistentes a Piscirickettsia salmonis Los programas de mejoramiento genético han sido de gran utilidad en producción acuícola, aumentando el retorno económico de la industria. En el caso de resistencia a enfermedades los programas de selección tradicionalmente han utilizando la información de parientes, debido a la dificultad que presenta el evaluar la resistencia a enfermedades, en el propio individuo a seleccionar. Por ello, al no utilizar la información directa de los individuos a seleccionar, el progreso genético por generación se ve afectado, debido a que la precisión de los valores genéticos para la característica es menor que la obtenida cuando el propio reproductor es evaluado [27]. Una opción para utilizar la información de los individuos a seleccionar, es por medio de la utilización de marcadores moleculares asociados con la característica. En este ámbito, la selección asistida por marcadores (MAS) y la selección genómica (GS) representan dos alternativas de gran desarrollo en los últimos años [28, 29]. Para poder incorporar un rasgo a un programa de selección es necesario que presente suficiente variabilidad genética en la población. En este sentido, la heredabilidad (h2) representa la proporción de la variación fenotípica total atribuible a la variación genética aditiva. Conocer el valor de h2 para la característica de resistencia a SRS es necesario para poder determinar si es factible mejorar esta característica, debido a que valores bajos indicarían que un mejoramiento ambiental permitiría mejorar la sobrevida. La heredabilidad para resistencia a SRS ha sido estimada por diversos autores (Figura 3) [30-34]. En el cuadro 3, es posible observar que existe una gran variación entre los distintos autores, con heredabilidades en promedio cercanas a un 11%, hasta valores cercanos a un 40%, considerando toda la información disponible en distintas poblaciones de salmón [30, 34]. Aunque existen diferencias en las estimaciones, los autores concluyen que existe suficiente variación genética para mejorar la resistencia a SRS en el salmón Atlántico, aunque esta variacion parece ser dependiente del modelo de analisis [31]. Nuestros datos obtenidos desde una población comercial y del núcleo genético de Aquagen, señalan que la variación genética es relativamente alta para la creación y desarrollo de programas de mejoramiento genético altamente eficientes a nivel productivo para resistencia genética, considerando la información de marcadores moleculares. Recientemente, el laboratorio Favet-Inbiogen en conjunto con el consorcio Blue-Genomics, han realizado investigaciones para estimar la heredabilidad utilizando desafíos de cohabitación para la infección con Piscirickettsia salmonis, estimando el parentesco de toda la población, mediante el uso de marcadores obtenidos a través de chips de alta densidad [34]. Los resultados señalan que la heredabilidad para la característica de resistencia a SRS es consistente con lo observado en otras poblaciones comerciales de salmón [30], con valores de heredabilidad cercanos a un 40%. Estos resultados, además, son similares a la heredabilidad obtenida por medio del método de inyección intraperitoneal, siendo las correlaciones genéticas cercanas a 1. Estos resultados [34] se presentan in extenso en el XII simposio de genética en acuicultura (ISGA, 2015).

Para incorporar la resistencia a SRS en un programa de selección, es importante considerar las posibles correlaciones genéticas que pueda tener la resistencia a SRS con otros rasgos de interés, como rasgos productivos o resistencia a otros patógenos, ya sean bacterianos, virales o parasitarios. En este sentido, se ha determinado que la correlación genética de resistencia a SRS y peso corporal sería cercana a cero, encontrándose un valor levemente negativo que no sería significativamente distinto de cero; panorama similar a lo observado entre resistencia a SRS y resistencia a Caligus rogercresseyi, que presentarían correlaciones genéticas relativamente bajas [32]. Esta información ha sido además corroborada para otras características de interés productivo, tales como peso a la cosecha, filete y carga parasitaria por Martinez y col. (2012). Un punto importante a considerar en los programas de selección es que el potencial genético de los individuos seleccionados puede no expresarse completamente bajo las condiciones comerciales de producción. En este sentido la robustez juega un papel fundamental, ya que se define como la capacidad de un individuo para expresar su máximo potencial productivo en una amplia variedad de condiciones ambientales [35]. El concepto de robustez incluye rasgos que sean sensibles a condiciones ambientales adversas, como mortalidad y resistencia a enfermedades, así como otros rasgos de importancia. En los programas de selección no debe considerarse sólo el rasgo de resistencia a SRS de forma aislada, sino seleccionar peces que sean robustos, de forma que puedan sobrevivir a la infección con SRS en distintos ambientes y/o frente a distintas cepas de la bacteria, y que a su vez puedan tener un buen rendimiento en rasgos de interés productivos independiente de las condiciones ambientales en la cual se realiza la producción. Esto es de gran importancia para generar una producción sustentable y mantener buenos niveles de bienestar en los peces. Otro punto importante a considerar al evaluar la resistencia a SRS, es el fenotipo utilizado para medir la resistencia genética. Las evaluaciones más utilizadas se han realizado midiendo el carácter binario vivo/muerto, o el día de muerte desde iniciado el desafío, ambas generalmente evaluadas en desafíos experimentales. Los desafíos experimentales juegan un rol importante en la determinación de los individuos y familias más resistentes a una enfermedad, presentando ventajas sobre los brotes de campo en relación con disminuir el efecto de factores ambientales, controlar de mejor forma la dosis infectante y cepa utilizada, junto con manejar posibles co-infecciones con otros patógenos. No obstante, se debe tener en cuenta que los resultados obtenidos en desafíos experimentales pueden diferir de desafío en desafío, por lo cual es importante evaluar las correlaciones considerando estudios de campo y revalidaciones mediante desafíos controlados. Para otras enfermedades, tales como la Necrosis Pancreática Infecciosa [36], esto ha sido crucial para generar ovas mejoradas que se comporten de manera estable en producción. Aunque en el caso del IPN existiría un solo gen que explica mas del 80% de la variabilidad genética de la resistencia.

En Favet-Inbiogen, como una forma de mejorar la repetibilidad de los desafíos controlados al medir la mortalidad, se ha estudiado en familias susceptibles y resistentes al desafío experimental con P. salmonis la carga bacteriana asociada con el fenotipo de resistencia [37]. La carga bacteriana fue evaluada en riñón anterior y músculo de los individuos, detectando en las muestras la cantidad de bacteria por medio de PCR en tiempo real utilizando un fragmento específico de la sub-unidad ribosomal 23 S de la bacteria. El trabajo demostró que la mortalidad familiar es un factor directamente correlacionado con la carga bacteriana en ambos órganos, encontrándose diferencias significativas en la carga bacteriana entre susceptibles y resistentes. En base a lo anterior, la carga bacteriana podría ser una medición importante a considerar al evaluar resistencia a SRS en salmón Atlántico, especialmente considerando que no sólo es un factor asociado al nivel de resistencia, sino que además permitiría diferenciar los individuos que se comportan como tolerantes de los realmente resistentes, siendo estos últimos capaces de eliminar la bacteria, y no actuando como reservorio en la población. Este punto es de gran importancia para el control de la diseminación de la enfermedad. Existen pocos estudios respecto de la causalidad de la resistencia a SRS, representando un área de gran interés a profundizar. Investigaciones previas han estudiado la relación del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) con la resistencia a SRS en poblaciones de salmón Atlántico, salmón coho y trucha arcoíris [38]. Específicamente, se han encontrado diferencias alélicas en regiones del MHC clase II entre peces susceptibles y resistentes, tomados de brotes de campo. En este caso particular, la resistencia fue medida utilizando el estado de salud (sano/enfermo) en base a síntomas clínicos y no en base a la mortalidad de los individuos. Aunque el MHC podría representar un candidato interesante en resistencia a SRS, la selección de ciertas variantes del complejo, podría generar problemas en la robustez de la población seleccionada, lo que conllevaría a una pérdida del fitness de la población. Por ello, en términos prácticos, esta estrategia no ha sido utilizada a nivel mundial para la selección de reproductores.

Estudios en genómica funcional en la resistencia a SRS Se ha observado por medio de estudios de expresión génica, que los individuos susceptibles presentan un incremento en la respuesta inflamatoria y en genes de respuesta de fase aguda, con un incremento en la expresión de transcritos como interleuquina 1, haptoglobina y amiloide sérico A [37]. No obstante lo anterior, esta respuesta no sería protectiva, lo cual se evidenciaría por la alta carga bacteriana en los peces susceptibles. Este punto es importante a considerar, ya que una mayor respuesta inflamatoria no es, necesariamente, beneficiosa para el pez, debido a que una respuesta descontrolada a nivel inflamatorio repercutirá en la condición del pez al producir daño tisular, generando un detrimento en la salud que puede llegar incuso a la muerte del mismo. En un ámbito más amplio, utilizando secuenciación de última generación, se ha estudiado las diferencias transcripcionales entre individuos susceptibles y resistentes a la infección con Piscirickettsia salmonis, los cuales adicionalmente pertenecían a las familias más resistentes y más susceptibles a nivel de desafío experimental [39]. En este estudio se utilizaron muestras de riñón anterior e hígado de ambos grupos (susceptibles y resistentes), realizando el análisis de expresión diferencial considerando todos los transcritos presentes. Los resultados mostraron que hígado presenta una mayor respuesta transcripcional con 1.110 genes diferencialmente expresados, mientras que riñón anterior presentó 474 genes diferencialmente expresados. Adicionalmente, se observó una respuesta órgano específica, la cual se puede observar en el bajo número de genes diferencialmente expresados en ambos órganos (Figura 4). Este patrón de expresión mostraría que existirían diferencias en cómo estos órganos responden al estar expuestos al patógeno. Al estudiar los procesos biológicos diferencialmente expresados en cada órgano se observaron diferencias significativas entre ambos grupos. El grupo susceptible presentó un aumento significativo en genes asociados con procesos inflamatorios, así como también genes asociados a respuesta de fase aguda en ambos órganos. Adicionalmente, se observaron genes asociados con el sistema del complemento diferencialmente expresados en hígado, junto con genes de respuesta inmune innata en ambos órganos. En el caso del grupo resistente, se observó un incremento en genes asociados con estrés oxidativo y genes antioxidantes en riñón anterior. Adicionalmente, se observó un aumento en genes asociados a reconocimiento de patógenos, así como en genes involucrados en la fusión del fagosoma-lisosoma. Por último, se observó una sobre-expresión en genes relacionados con transporte de oxígeno y de hierro en ambos órganos. De esta forma, es posible concluir que los mecanismos involucrados en la resistencia a SRS estarían relacionados con la capacidad de los peces resistentes de evitar el daño tisular, producto de la respuesta inflamatoria y estrés oxidativo; destrucción de la bacteria a nivel intracelular, dado por la exitosa fusión fagosoma-lisosoma; junto a una eficiente homeostasis del hierro y oxígeno. Estos resultados corroboran lo previamente determinado en [37], mostrando que una respuesta inmune exacerbada puede no ser óptima como mecanismo de defensa contra este patógeno. La complejidad de los mecanismos biológicos involucrados en la resistencia a SRS dan cuenta que este rasgo es un carácter complejo dado por múltiples genes, aunque existen regiones específicas a nivel genoma que están asociadas con la resistencia. Esta información debe ser considerada al momento de realizar estudios, con el fin de generar programas de selección basada en marcadores moleculares para la resistencia a SRS en el salmón Atlántico.

Conclusiones Es evidente que el SRS es uno de los mayores problemas para la industria salmonicultora, y que a pesar de todos los esfuerzos realizados para controlar la enfermedad, sigue generando cuantiosas pérdidas al sector. De allí que la necesidad de generar programas eficientes de selección genética para resistencia a SRS sea altamente prioritaria. En este artículo se han mostrado los avances con respecto al conocimiento existente sobre la resistencia a SRS y los factores biológicos que estarían participando en la misma. El rasgo de resistencia a SRS ha mostrado tener suficiente variabilidad genética como para producir progresos genéticos en programas de selección. No obstante, la forma en la cual se evalúa la resistencia es un punto importante a considerar al momento de realizar los programas de selección. Finalmente, el conocimiento existente sobre los genes participantes en la resistencia a SRS ha mostrado ser una característica compleja. Se requerirán mayores investigaciones para comprender la causalidad de la resistencia y generar programas eficientes de mejoramiento genético basados en información molecular, disminuyendo así el impacto de esta enfermedad en el sector productivo, tanto en lo que se refiere al uso de antibióticos así como en el bienestar de los peces. En el laboratorio Favet-Inbiogen, se está considerando además información de la propia bacteria, de forma tal de poder entender de qué forma la interacción huésped-patógeno influye en la resistencia genética a enfermedades.

Agradecimientos Proyecto Fondecyt regular 1120608 y Programa de becas de Doctorado nacional de Conicyt y Corfo.

Referencias bibliográficas Para revisar la literatura citada puede descargarla desde https://www.salmonexpert.cl/?page_id=221