La Caligidosis, una parasitósis que complica a la salmonicultura chilena

Este capítulo entrega una revisión de la problemática, realizada con la colaboración de la Dra Andrea Peña, investigadora del Laboratorio de la empresa Marine Harvest Chile.

1.- ¿Que es la caligidosis? Los copépodos ectoparásitos, Lepeophtheirus salmonis en Norteamérica y Europa y Caligus rogercresseyi en Chile, poseen un amplio rango de hospederos que incluyen a la mayoría de las especies salmonídeas cultivadas en agua de mar (Oncorhynchus spp., Salmo spp., and Salvelinus spp.) (Kabata, 1979; Gonzalez y col., 2000; Boxshall y Bravo, 2000). La diferencia de susceptibilidad entre hospederos ha sido ampliamente reportada (Johnson y Albright, 1992a; Dawson y col., 1997; Fast y col., 2002a, 2003; Jones y col. 2007; Braden y col., 2012). En salmón del Atlántico, Salmo salar, se ha observado que L. salmonis se desarrolla rápidamente, exhibiendo altas intensidades de infección en comparación con otras especies salmonídeas, especialmente salmón coho, Oncorhynchus kisutch (Johnson y Albright, 1992b; Johnson, 1993) y salmón rosado, Oncorhynchus gorbuscha (Jones y col., 2007; Braden y col., 2012). Carvajal y col. (1998) señalaron a C. rogercresseyi parasitando especies de cultivo y silvestres (truchas, salmón del Atlántico, salmón coho, robalos, pejerrey, lenguado), en tanto que González (2006), en ensayos realizados en condiciones controladas, describió la nula selectividad de hospedero para el estadio infectante de C. rogercresseyi. Peces enfermos por esta parasitosis han sido caracterizados por heridas en piel y aletas, inapetencia, cambios en peso y factor de condición, así como inmunosupresión (Leigh y col., 1999; Rozas y Asencio, 2007). Junto con los problemas inmunológicos, a los calígidos se los asocia como vectores o transmisores de enfermedades bacterianas (SRS) y virales (ISAv), las que conllevan a la mortalidad del pez hospedero, al actuar en conjunto (Nylund y col., 1994; Oelckers y col, 2014). Sin embargo, definir la intensidad de infección causante de problemas de salud en los hospederos, tanto para L. salmonis como para C. rogercresseyi, es un tema en permanente estudio. Grimnes y Jakobsen (1996), Björn y Finstad (1997), señalaron que las infestaciones con L. salmonis superiores a 30 parásitos/pez, en post-smolts de salmones y truchas, provocaron su muerte. Finstad y col. (2000) reportaron que más de 30 chalimus podrían matar a smolts de salmón de 40 g. Wagner y col. (2008) señalaron que los niveles de infestación subclínica (< 0,2 piojos/g pez) de L. salmonis provocan cambios fisiológicos y de comportamiento en el salmón a nivel de secreción de mucus, función de los macrófagos y regulación de los genes de respuesta inflamatoria. Para 0,1 piojos/pez se han registrado reducción de nado entre un 19 y 22%, ritmo cardiaco alterado y desbalance iónico. En la Fig. 1 se representan los resultados de experiencias en laboratorio, mostrando las respuestas fisiológicas para distintos niveles de infección por L. salmonis.

Ya sea que las diferencias en el desarrollo e intensidad de infección entre hospederos se deban al contenido nutricional en el mucus, piel y sangre, de los cuales el piojo de mar se alimenta, o a la capacidad de evasión de los sistemas de defensa del pez, o a una combinación de estos factores, aún no existe completa claridad acerca de los mecanismos involucrados en el éxito o fracaso de las infestaciones. En salmón coho se ha documentado su resistencia tanto a L. salmonis (Johnson y Albright, 1992a; Fast y col., 2002a) como a C. rogercresseyi (Carvajal y col., 2000). Fast y col. (2002a) reportaron que en un desafío de cohabitación, L. salmonis inicialmente era capaz de infectar con sus larvas a la misma densidad, tanto a salmón coho como a salmón del Atlántico y a trucha arcoíris, sin embargo, tras dos semanas, el número de parásitos decrecía rápidamente en salmón coho. En este artículo se intenta mostrar algunos de los estudios y sus conclusiones para dilucidar los procesos biológicos que forman parte de las interacciones entre parásito calígido y su hospedero.

2.- Barreras físicas en el pez contra patógenos 2.1.- La epidermis La capa de epidermis de la piel es una de las primeras líneas de defensa contra patógenos, al proveer protección física y secretar mucus. Fast y col. (2002b) reportaron diferencias tanto en la morfología de la piel, como en la composición del mucus de tres salmónidos con diferentes susceptibilidades a L. salmonis: salmón del Atlántico, trucha arcoíris y salmón coho. Por ejemplo, la trucha arcoíris exhibe una epidermis más gruesa y con células mucosas más abundantes que las otras dos especies. Esto podría ayudar a explicar la robustez de la trucha arcoíris como especie de cultivo (Clarke y col., 1996). En tanto, el salmón coho muestra una epidermis más delgada que la trucha arcoíris y con menos células mucosas (Fig. 2).

El salmón del Atlántico posee la epidermis más fina con muy pocas células mucosas en comparación a las otras dos especies. Otro aspecto interesante que reportaron fue que la epidermis del salmón coho cultivado en agua de mar contiene células acidofílicas, que no fueron observadas en trucha arcoíris ni en salmón del Atlántico. Los patrones de tinción y localización de las células sugerirían que se trata de células sacciformes, como han sido descritas en otros teleósteos (Mittal y col., 1981) (Fig. 3). Las células sacciformes no son una característica consistente en la epidermis de salmónidos (Elliott, 2000), éstas han sido observadas, sin embargo, en trucha café y en trucha alpina y su número podría variar con la temperatura o entre géneros (Pickering y Fletcher, 1987). En salmón coho, estas células se caracterizan por tener una vacuola o inclusión eosinofílica que ocupa la mayor parte del volumen celular, desplazando el núcleo hacia la periferia. La función precisa de estas células aún no ha sido determinada. Se ha observado que la prevalencia de células sacciformes aumenta ante una infección con el parásito de la piel Ichthyobodo en trucha alpina y en trucha café (Pickering y Fletcher, 1987). Basados en observaciones ultraestructurales, Pickering y Fletcher (1987), sugirieron que las células sacciformes secretaban proteínas, que debían proteger al pez ante infecciones o daño por ectoparásitos.

En un análisis de los tejidos dañados y contenidos estomacales, Valenzuela (2009) demostró que C. rogercresseyi se alimenta principalmente de mucus y tejidos epidérmicos, quedando al descubierto el cartílago en las aletas en donde fijaron su filamento, incrementando el radio de daño a medida que los copepoditos se desarrollaron hasta chalimus 4 (Fig. 4). La reducción de tejido se correlacionó positivamente con el desarrollo de los 4 estadios chalimus, los que permanecieron fijos en el mismo sitio desde ocurrida la infección como copepoditos. Esta especie no genera filamento en cada estadio, sino que presenta crecimiento del filamento rostral desde la zona próximal al cefalon. L. salmonis es una especie que genera un nuevo filamento para cada uno de los estadios chalimus, por lo que se puede fijar en diferentes sitios sobre el pez durante cada estadío larval parásito. La diferencia entre especies, en conducta, tiempo y profundidad depredatoria, podría caracterizar el nivel de daño y respuesta del hospedero, hipótesis que requiere de un análisis posterior.

2.2.- Proteínas de la mucosa Diferencias en la actividad de enzimas antimicrobianas, como lisozima y proteasas, y su relación con la estructura y composición del mucus, así como capas de epidermis, podrían también estar asociadas con las distintas susceptibilidades a enfermedades. Enzimas como lisozima y otras proteínas antibacterianas han sido localizadas en el mucus (Cole y col., 1997; Dalmo y col., 1997; Ebran y col., 2000; Oren y Shai, 1996; Smith y col., 2000; Patrzykat y col., 2001). La lisozima rompe las uniones glicosídicas de la capa de peptidoglicano y, en el pez, es un efectivo agente contra bacterias Gram-negativas y Gram-positivas (Grinde, 1989). Se ha observado su presencia en tejidos de trucha arcoíris ricos en leucocitos y en zonas donde el riesgo de infecciones por bacterias es alto, tal como en la capa de mucus de la epidermis y las branquias (Lindsay, 1986). La trucha arcoíris tiene una actividad de lisozima muy alta en el mucus comparada con las otras dos especies, tanto en agua dulce como en agua de mar (app 5-7 veces) (Fast y col., 2002a). La fosfatasa alcalina es una enzima lisosomal cuyo rol, se cree, sería de modulación de la curación de una herida en sus primeras etapas (Iger y Abraham, 1994). No obstante, su función específica es aún desconocida. Se ha demostrado que niveles elevados de fosfatasa alcalina en mucus o células secretoras de mucus aumentan bajo condiciones de vida estresantes en carpa (Iger y Abraham, 1997) y durante infecciones parasíticas en salmón del Atlántico (Ross y col., 2000). Las proteasas también son potenciales factores del mucus, que contribuyen a la inmunidad innata. Se ha reportado que las proteasas en el mucus de salmón del Atlántico, salmón coho y trucha arcoíris son predominantemente serine-proteasas y metaloproteasas (Firth y col., 2000; Fast y col., 2002a). En el caso de salmón coho, la actividad proteolítica en el mucus parece tener una alta proporción de metaloproteasas sobre serine-proteasas en comparación con la trucha arcoíris y el salmón del Atlántico. Las tres especies poseen metaloproteasas en el rango de masa molecular de 45-85 kDa (Fast y col. 2002b), que corresponde al rango de tamaño de las colagenasas y gelatinasas eucarióticas, enzimas involucradas en inflamación y reparación de tejidos (Seiki, 1998; Foulon y col., 1998). Las tres especies salmónidas tienen serine-proteasas de alto peso molecular (>60 kDa), pero sólo el mucus de trucha arcoíris y salmón coho muestra serine-proteasas de bajo peso molecular (18 kDa) (Fast y col., 2002b). La tripsina es una serine-proteasa de bajo peso molecular (~18-kDa) que ha sido aislada previamente del mucus de trucha arcoíris (Hjelmeland y col., 1983), donde ha mostrado actividad microbiocida contra bacterias Gram-negativas, y podría jugar un rol importante en inmunidad innata. Aunque la tripsina ha sido detectada en las células secretoras de mucus en la epidermis de salmón del Atlántico (Braun y col., 1990), actividad de tripsina endógena no ha sido aún detectada en su mucus (Firth y col., 2000; Ross y col., 2000). Proteínas extracelulares e intracelulares han sido identificadas a altos niveles en mucus de epidermis en salmón del Atlántico, incluyendo aquellas en las que se ha demostrado roles duales (Easy y Ross, 2009). Entre las proteínas intracelulares con funciones extracelulares se encuentran la calmodulina y la keratina (Lazarides, 1980; Wenqiang y col., 1997; Easy y Ross, 2009). La calmodulina es una proteína asociada a calcio, involucrada en la polimerización de los filamentos de actina (Wang y col., 2002). El rol extracelular de esta proteína está en la regulación de la permeabilidad de la piel del pez al agua e iones (Flik y col., 1984). La keratina también se la puede localizar intra- y extracelularmente, representando una familia de polipéptidos en el rango de 40 a 65 kDa de masa molecular (Lazarides, 1980); extracelularmente, es el principal producto de diferenciación de las células epidérmicas. Las escamas están compuestas de keratina, por lo que no es extraño encontrarla en el mucus. La keratina actúa en la regulación de la proliferación celular y, junto con la actina, es esencial para la reparación de tejido epidérmico dañado. Otro tipo de proteínas identificadas son las proteínas de shock térmico, como la Hsp90, que regula la homeostasis intracelular y actúa también como antígeno de tumores para obtener una respuesta inmune del hospedero (Tsutsumi y Neckers, 2007). La histona es bien caracterizada como proteína ligada a ADN, pero también es un precursor de péptidos antimicrobianos extracelulares (Lazarides, 1980; Richards y col., 2001; Augusto y col., 2003). En el mucus también se han identificado proteínas extracelulares, entre ellas la ictacalcina (rol en el flujo de calcio a nivel de la interfase epidérmica (Hsiao y col., 2003)), hemopexina (beta-glicoproteína con alta afinidad al hierro, protegería las células de daño por estrés oxidativo y transporta hierro a los hepatocitos para endocitosis (Tolosano y Altruda, 2002; Paoli y col., 2002), complemento, lectina (reconocimiento de patógenos y respuesta inmune) (Ewart y col., 1999; Soanes y col., 2004; Gonzalez y col., 2007), apolipoproteínas (regulan el metabolismo de lipoproteína y participan en el transporte y distribución de lípidos en las células y tejidos (Mahley y col., 1984)). También muestran una potente actividad antimicrobiana contra bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (Concha y col., 2003)) y transferrina (principal rol es secuestrar el hierro y llevarlo a una forma redox-inactiva, restringiendo su disponibilidad para los patógenos (Van Campenhout y col., 2003)), conocidas como proteínas típicamente de plasma.

3.- Productos de secreción/excreción de calígidos Los calígidos como L. salmonis y C. rogercresseyi pasan la fase parasítica completa de su ciclo de vida en contacto con el mucus de la piel de su pez hospedero (Johnson y Albright, 1992). En L. salmonis y C. rogercresseyi (Valenzuela, 2009), los estadíos de chalimus se alimentan exclusivamente de mucus y epidermis, pero los estadíos preadulto y adulto son capaces también de alimentarse de sangre (Brandal y col., 1976). Los productos de secreción y excreción (SEP) han sido parcialmente caracterizados en L. salmonis (Firth y col., 2000; Fast y col., 2003, 2007). Firth y col. (2000) reportaron la liberación de proteasas tipo tripsina en presencia de mucus de salmón del Atlántico, posiblemente para apoyar la alimentación y/o para eludir la respuesta inmune del hospedero. Las proteasas tipo tripsina son proteasas digestivas y, como se mencionó anteriormente, han sido encontradas en el mucus de peces infectados con el piojo de mar. Sin embargo, este grupo de enzimas parecen expresarse tanto en estadíos de copepoditos, que no se alimentan, como en adultos (Kvamme y col., 2004). L. salmonis produce varias tripsinas diferentes por la vía de varios tipos celulares del revestimiento de su aparato digestivo (Kvamme y col., 2004). Por otro lado, Fast y col. (2003) identificaron prostaglandina E2 (PGE2) en las secreciones de L. salmonis. Se piensa que la PGE2 regula la vasodilatación y actúa como agente anticoagulante, además de participar en la regulación de linfocitos T (Williams y Higgs, 1988; Betz y Fox, 1991). La presencia de PGE2 es vista como un mecanismo del ectoparásito para evadir la respuesta inmune del hospedero, posiblemente a través de sus efectos antiinflamatorios e inmunosupresores. En cuanto a los productos de secreción/ excreción del parásito, se ha demostrado que fracciones que no contenían PGE2 también eran capaces de inhibir por sí solas la respuesta inflamatoria del pez (Fast y col., 2007). Esta observación lleva a la pregunta de ¿cuál es el rol que estos compuestos tienen sobre la interacción entre el parásito y el hospedero? Basados en otros estudios, la falta de respuesta inflamatoria parece estar correlacionada con la susceptibilidad del hospedero al piojo de mar (Fast y col., 2002a). Los estadíos de chalimus de los parásitos están fijos a un solo lugar en el pez por varios días, sin mostrar respuesta en las especies susceptibles (Fig. 6). Aún más, histologías de los tejidos del hospedero en el sitio de acoplamiento y alimentación de parásitos adultos muestran que la inflamación sólo ocurre en la periferia de la lesión y no en tejidos alrededor del cefalotórax del ectoparásito (Jonsdottir y col., 1992). Existe fuerte evidencia de que la inmuno-modulación del hospedero ocurre en el sitio de alimentación. No obstante, se ha visto que el mucus de la piel de especies relativamente resistentes, como salmón coho, estimula la liberación de SEP en L. salmonis a un nivel significativamente más reducido que en hospederos más susceptibles, como lo evidencia la falta de actividad de tripsina (Fast y col., 2003). Esta falta de liberación de SEP o su composición podría permitir que el proceso de inflamación en salmón coho proceda como sería esperado, lo cual no sucede en especies susceptibles como salmón del Atlántico. Desde el punto del parásito, la liberación de PGE2, a través de su acción vasodilatadora, debería incrementar el flujo de sangre al sitio de alimentación. Sin embargo, un efecto negativo de esto sería el aumento de la exposición a células presentadoras de antígenos, anticuerpos, especies reactivas de oxígeno, agentes coagulantes. La liberación simultánea de compuestos antiinflamatorios podría aliviar estos efectos tóxicos. La prostaglandina E2, aunque podría aumentar el flujo de sangre, puede reducir el reclutamiento de leucocitos y las capacidades celulares de presentación de antígenos, a través de la inhibición de la expresión de los genes del complejo principal de histocompatibilidad de clase I y de clase II (MHCI y MHCII). Uno o más compuestos de SEP (productos secretores/excretores) también exhibirían propiedades anti-reclutamiento de leucocitos a través de la inhibición de citoquinas como IL-1 β y efectores posteriores como IL-8 (Fast y col., 2007). Los componentes secretores/excretores proveen a los ectoparásitos con los elementos para modular la respuesta inmune de sus hospederos. Su liberación continua podría ser la responsable de las diferencias entre infecciones exitosas y no exitosas, como se ve en especies de peces susceptibles y resistentes. Aunque es más probable que la inmunosupresión ocasionada por las secreciones del piojo en el pez ocurra en los sitios de acoplamiento y alimentación, un efecto acumulativo de varios parásitos podría eventualmente causar la total inmunosupresión del hospedador.

4.- Efectos en el sistema inmune de los peces Como se mencionó anteriormente para L. salmonis, las moléculas liberadas por esta especie sobre hospederos susceptibles, generan en éstos la supresión de su sistema inmune a través de la modulación de la transcripción de genes de la respuesta inflamatoria y la reducción de la actividad fagocítica y oxidativa de sus macrófagos. Tadiso y col. (2011a) encontraron también una subregulación de la presentación de antígenos en salmón del Atlántico luego de la infección con L. salmonis, la que posiblemente afectaría la respuesta inmune adaptativa convencional mediada por células T. Otra de sus observaciones fue el cambio del carácter de la inflamación durante la transición del parásito de copepodito a chalimus (Fig. 7). Ellos determinaron que un aumento de transcritos de inmunoglobulinas en la piel y en el bazo podría indicar el inicio de la respuesta inmune adaptativa en estadíos tardíos de infección. Los anticuerpos en la superficie del mucus de la piel pueden bloquear la infestación por ectoparásitos o reducirla (Maki y Dickerson, 2003). IgT/IgZ es una clase de anticuerpo específico de teleósteos descubierto por primera vez en trucha arcoíris y en pez zebra (Hansen y col., 2005; Danilova y col., 2005). En salmón hay tres subvariantes de IgT altamente similares, pero que podrían ser reguladas diferencialmente (Yasuike y col., 2010; Tadiso y col., 2011b). IgT está asociada a la inmunidad en la mucosa, similar a la IgA de mamíferos (Zhang y col., 2010). Esta inmunoglobulina podría cubrir las bacterias en el lumen del intestino, previniendo de esta manera su acoplamiento e invasión en el epitelio intestinal (Zhang y col., 2010). Mientras los niveles de transcritos de IgT e IgM en los tejidos de la mucosa en salmón del Atlántico sin parásitos son relativamente bajos, se pudo documentar un incremento de hasta 10 veces en la piel de los peces infectados con L. salmonis (Tadiso y col., 2011b). En el caso de C. rogercresseyi en Chile, la investigación de la respuesta innata temprana del salmón del Atlántico al desafío con este parásito, así como de otros peces hospederos, está en sus inicios. El Dr. Christopher Hawes, investigador de Ewos Innovation Chile, se encuentra desarrollando un estudio en que aborda este tema, mediante el rastreo de compuestos producidos durante la respuesta inmune innata temprana, “biomarcadores”, utilizando una gama de técnicas. Sobre esta base, espera generar modelos inmunológicos detallados de esta respuesta. También se someterán al desafío otras especies salmonídeas menos susceptibles y se estudiarán de la misma forma, con el fin de realizar comparaciones e identificar la base inmunológica para las diferencias observadas en la susceptibilidad de la especie. Además de abordar los temas anteriormente expuestos, este proyecto también propone investigar, en forma ambientalmente amigable, tratamientos alternativos basados en alimentos no quimioterapéuticos para el control de la infestación de C. rogercresseyi en salmón del Atlántico.

5.- ¿Y cómo reacciona el sistema inmune de peces resistentes? Como se ha mencionado anteriormente, la susceptibilidad al piojo de mar varía entre las distintas especies de salmónidos. Los estadíos juveniles de estos ectoparásitos causan usualmente sólo heridas abrasivas en la piel de su hospedero, no obstante, esto conlleva a respuestas sistémicas de stress y modulación de su fisiología y de su sistema inmune (Wagner y col., 2008). Tanto el salmón rosado como el coho rechazan exitosamente los parásitos durante los estadíos de chalimus, mientras que especies como el salmón del Atlántico y el salmón chum, fallan en iniciar el proceso inflamatorio, sin mostrar reacción aparente en el tejido donde está acoplada la larva (Johnson and Albright, 1992; Fast y col., 2002a; Jones y col., 2007). La habilidad para deshacerse de los parásitos puede estar determinada por las respuestas hiperplástica e inflamatoria en la epidermis y el tejido dérmico subyacente (Johnson y Fast, 2004). El fenotipo hiperinflamatorio del salmón coho se manifiesta dentro del día posterior a la infección y es caracterizada por una afluencia rica en neutrófilos en el sitio del acoplamiento. El infiltrado inflamatorio persiste durante todo el período de desarrollo del piojo en el salmón coho y es acompañado de una hiperplasia epitelial que, en algunos casos, encapsula completamente al parásito. Comparaciones intraespecíficas revelan la asociación de una regulación temprana de citoquinas pro-inflamatorias IL-1β, IL-8 y TNF-α con la expulsión mejorada del chalimus en especies resistentes, lo que se atribuye a una respuesta exagerada de linfocitos T efectores de tipo 1 (Th1), cuyos blancos son normalmente virus y bacterias. Skugor y col. (2008) demostraron que la rápida sobre-regulación de genes tipo inmunoglobulina en riñón anterior y bazo, junto a un panel de genes de respuesta inmune en las áreas intactas de la piel, indican una rápida activación de la respuesta antiparasítica sistémica. Braden y col. (2012) demostraron que especies refractarias a L. salmonis, como el salmón rosado, serían capaces de expresar no sólo los genes de respuesta pro-inflamatoria anteriormente mencionados, e inflamatoria a través de COX-2 (involucrada en el metabolismo del ácido araquidónico para la producción de prostaglandinas, por lo que actúa como reguladora de la inflamación), sino también genes de respuesta de fase aguda como la proteína C-reactiva (CPR), la serum amyloid-P (SAP) y serum amyloid-A (SAA), involucradas en la respuesta celular innata. Si bien, la sobreexpresión de metaloproteasas de la matriz (MMPs; remodelan y degradan el colágeno, removiendo la matriz extracelular durante procesos patológicos) ha sido observada en la piel de las especies de salmónidos susceptibles y resistentes (Skugor y col., 2008; Tadiso y col., 2011a; Braden y col., 2012) ante infecciones con larvas de L. salmonis, una expresión mucho más pronunciada fue generada en salmón rosado, sugiriendo un mecanismo especie-específico en el que la capacidad de remodelación del tejido está aumentada a pesar de la infección por el piojo.

RESUMEN En siete capítulos se presentará una visión actualizada del conocimiento de los caligidos que impactan la industria salmonicultora mundial, con el objetivo de proporcionar herramientas para el mejoramiento de la vigilancia y manejo de esta enfermedad. En este artículo se presentó una descripción biológica de la relación parásito-hospedero, detallando los cambios observados en los peces hospederos al ser parasitados por Lepeophtheirus salmonis, así como los procesos involucrados en la infestación. Para Caligus rogercresseyi no existe información documentada hasta hoy, sólo investigaciones en curso, las que se espera entreguen resultados a corto plazo. En los próximos capítulos se analizarán los avances en genómica de estos parásitos, así como las estrategias utilizadas para su vigilancia y control.

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