Alternativas para la reducción de la inflamación inducida por soya Impacto de los ingredientes vegetales sobre el tracto digestivo

Jaime Romero, PhD; Profesor Asociado, Laboratorio de Biotecnología, Director Unidad de Alimentos INTA, Universidad de Chile

Alteraciones en el tracto digestivo inducidas por ingredientes vegetales (soya). El salmón del Atlántico (Salmo salar L.) es un pez carnívoro en su condición natural, de esta forma la inclusión de ingredientes derivados de plantas en sus dieta, expone al sistema digestivo a un importante número de compuestos a los cuales este pez no está habituado. Típicamente, el tracto digestivo de un pez carnívoro tiene una longitud cercana, aunque menor, a la longitud del cuerpo; en contraste, en los peces herbívoros y omnívoros, la longitud del tracto digestivo puede alcanzar hasta 20 veces la longitud corporal. Esto se condice con las acciones requeridas para transformar lo ingerido en compuestos asimilables para el pez. El uso de dietas vegetales en salmón del Atlántico ha mostrado que, en particular, inclusiones de harina de soya puede llevar al desarrollo de inflamación en la parte distal del intestino (Collins y cols. 2012). Éste es un fenómeno conocido como enteritis distal y ha sido reportado en otros teleósteos, como la trucha arcoíris y la carpa, los cuales presentan reacciones similares tras la inclusión de harina de soya en la dieta (Merrifield y cols. 2012). Debido a su disponibilidad y competitivo precio, la harina de soya se ha usado como sustituto de la harina de pescado en el cultivo de salmónidos y en alimentos para la acuicultura. Sin embargo, su uso está restringido porque provoca enteritis. Esta alteración se observa cuando se incluye soya cerca o por sobre el 20%, y se caracteriza por fuertes cambios morfológicos en la mucosa intestinal, que pueden afectar el crecimiento de los peces y su rendimiento productivo (Collins y cols. 2012). Las alteraciones producidas por los elementos vegetales introducidos en la dieta de peces es un campo muy activo de investigación actualmente. De hecho, recientemente, el grupo de Krogdahl, ha reportado los efectos de la dieta rica en soya sobre el transcriptoma de salmón usando microarreglos. Estos autores describen que cuando un salmón cambia su dieta desde una en base a harina de pescado a una conteniendo soya (20%), ocurren notables cambios en el transcriptoma, revelando una reacción inmunitaria, acompañada de alteraciones en la integridad de membrana intestinal y sus funciones (Sahlmann y cols. 2013). Esta disrupción en la mucosa intestinal se ve reflejada en la morfología del intestino (Bakke-McKellep y cols. 2007; Knudsen y cols. 2005). Estos autores describen los efectos de las dietas ricas en soya (20-40% de la proteína total) sobre la histología del tejido en el intestino: -acortamiento de la altura de los pliegues de la mucosa. -pérdida de las vacuolas características de las células absorbentes en el epitelio intestinal. -engrosamiento del estroma central dentro de los pliegues de la mucosa. -gran infiltración de células inflamatorias (leucocitos, macrófagos) en la lámina propia, señalando la inflamación. En la figura siguiente (Fig.1) se muestran imágenes representativas de las alteraciones de la mucosa al exponerse a la dieta rica en soya. En el sector izquierdo se muestra la mucosa normal en un salmón sometido a dieta de harina de pescado; se observan largos pliegues de la mucosa (PM) y, en ellos, las vacuolas supranucleares (VSN), con una delgada lámina propia (LP). En el sector derecho, se observa el efecto de una dieta rica en harina de soya con acortamiento de los pliegues y una lámina propia engrosada y con infiltración de granulocitos (IG).

Siendo el desarrollo de dietas un área de amplia investigación en acuicultura, aun no se ha determinado con precisión cuál de los componentes de la soya ejerce el principal efecto en esta alteración inflamatoria, aunque los candidatos más estudiados son las saponinas, por su efecto sobre las membranas, y las proteínas de soya como la lectina, por su unión a la mucosa intestinal del salmón. Uno de los mecanismos más propuestos para dar cuenta de la enteritis, es que el daño inflamatorio podría ser consecuencia de un incremento en la permeabilidad intestinal promovida por las saponinas. Esto se traduce en mayor exposición de la mucosa a los antígenos de la soya y quizás a la microbiota intestinal (Bakke-McKellep y cols. 2007; Reveco y cols. 2014), provocando señales de inflamación y migración de células del sistema inmune.

Efecto de componentes vegetales ensayados en peces modelo El pez cebra (Danio rerio), ha surgido como un modelo biológico muy importante en los estudios de biología del desarrollo y genética, en diferentes aspectos de la biología de vertebrados, e incluso como un modelo experimental en las enfermedades humanas y los estudios biomédicos. Las características que hacen a este pez tan atractivo y popular como modelo científico son: su pequeño tamaño, la facilidad de su crianza y mantenimiento, su rápido desarrollo, el breve tiempo que transcurre de una generación a otra y su transparencia en los estados tempranos de su desarrollo. Un punto esencial, es que se ha avanzado en la secuenciación de su genoma, lo que permite la disponibilidad de una gran cantidad de herramientas moleculares desarrolladas para estudiar pez cebra y la expresión de sus genes (Howe y cols. 2013). Se ha propuesto el uso de pez cebra para estudios de nutrigenómica, donde este modelo pueda dar cuenta de las respuestas transcriptómicas asociadas o derivadas de una intervención dietaria (Ulloa y cols. 2011). En este contexto, se ha propuesto emplear pez cebra para el estudio de las bases de la enteritis. En este fenómeno, estudiado en peces de acuicultura, existen probablemente mecanismos inmunológicos subyacentes a esta patología, sin embargo, los procesos inflamatorios precisos no han sido clarificados. Es aceptado que estos efectos son mediados, al menos en parte, por algunos factores antinutricionales de la soya como la saponina. La saponina está presente en muchas plantas, como la arveja, el lupino y la maravilla. No obstante, en la soya, la saponina alcanza niveles elevados del orden de 1–5g/kg. En un estudio ya clásico, Knudsen incorporó extractos alcohólicos de soya a dieta de salmón y dedujo que la saponina de soya más un componente no identificado eran los principales contribuyentes a la generación de enteritis en el salmón. Las respuestas inmunológicas derivadas de la inclusión de soya en la dieta de salmón han sido reveladas recientemente por Kortner y cols. (2012). En este estudio, la saponina fue incluida en diferentes dietas vegetales (excepto harina de soya) y la respuesta transcriptómica fue evaluada usando microarreglos. La combinación de saponina con concentrado proteico de arveja produjo los más altos niveles de enteritis evaluados, tanto mediante parámetros histológicos como por la inducción de muchos genes, incluyendo citoquinas y genes asociados con NFkB y TNF-a, así como con reguladores de la función de células T. En forma similar, Chikwati y cols. 2012, evaluaron la suplementación de saponina de soya, en combinación con diferentes dietas vegetales. En la dieta basada en concentrado proteico de arveja, la suplementación con saponina indujo marcados efectos inflamatorios en el intestino y redujo la ingesta y la digestibilidad aparente de lípidos; esto en forma similar a lo que se observa en dietas con harina de soya. En contraste, la suplementación con saponina tuvo efectos claramente menores en combinación con harina de maravilla o gluten de maíz. Estos antecedentes revelaban un posible rol de las proteínas vegetales en la enteritis. En este contexto, en nuestro grupo del Laboratorio de Biotecnología del INTA, se optó por ensayar saponina incluida en alimento de una manera separada de los demás componentes de la soya. El diseño incluyó, como control, alimento de salmón que sólo contenía ingredientes marinos, es decir, harina y aceite de pescado. Las dietas experimentales fueron suplementadas con saponina de soya (SAP) o bien, aislado proteico de soya (APS). Estos componentes fueron agregados en dos niveles. Un nivel bajo (low-SAP; low-APS), en cuyo caso estas dietas incorporan el elemento de la harina de soya en una proporción que se corresponde a una inclusión aproximada del 30% de harina de soya. El nivel alto de inclusión (high-SAP; high-APS) correspondió una suplementación equivalente a una dieta con 50% de harina de soya. Las dietas low imitan dietas corrientes usadas en acuicultura, mientras las dietas high corresponden a una aproximación experimental para revelar el efecto individual de los componentes de la soya sobre las señales inflamatorias. Para testear estas dietas se emplearon larvas de pez cebra que pudiesen ingerir alimento tamizado, tratándolas entre los 5 a 10 días postfertilización (dpf). Luego, las larvas fueron teñidas usando Sudan Black para visualizar los granulocitos y realizar su recuento. Sudan Black es una tinción clásica que se une preferentemente y con gran afinidad a los gránulos de los granulocitos. Las imágenes capturadas corresponden a la vista lateral de las larvas, para visualizar los granulocitos a lo largo el cuerpo y en una sección cercana al tubo digestivo. La figura siguiente (Fig. 2) muestra la tinción característica de los granulocitos en su sección izquierda. Una enmarcación negra indica la sección que fue considerada para el recuento de granulocitos y comparada entre el control y las larvas que recibieron dietas experimentales (como señalan las flechas). Como se observa en la imagen (2A), la dieta control presenta muy pocos granulocitos cerca del tracto digestivo en el sector analizado (promedio 16 granulocitos). En contraste, los peces que recibieron proteína de soya (high-APS, 2B) presentan un gran número de granulocitos cercano al tracto digestivo (prom. 23 granulocitos). Un efecto similar fue el encontrado para los peces alimentados con high-SAP. Sin embargo, los peces alimentados con low-SAP o low-APS mostraron, aunque una tendencia a recuentos altos. Estas diferencias no fueron significativas respecto al control. Destaca, entonces, el efecto de las dietas de alta inclusión, que ejercieron un marcado aumento de los granulocitos con diferencias significativas respecto del control, lo cual revela la importancia de estos componentes de la soya incluidos en la dieta, en cuanto a la generación de señales hacia el sistema inmune.

Los resultados mostraron que la saponina a niveles de 50% de reemplazo ejerció un efecto inflamatorio potente en las larvas de pez cebra (Fuentes-Appelgren y cols. 2014). Esto quedó demostrado al incluir niveles importantes de saponina en el alimento que no contenía otros elementos derivados de la soya, como lo reflejan el aumento en el número de granulocitos y la aumentada expresión de genes relacionados con respuesta inmune e inflamación (Fig. 4). Estos resultados nos llevan a consolidar las evidencias obtenidas en otros peces, en los cuales la saponina es una agente importante en la inducción de señales de inflamación. Eso sí pez cebra requirió elevados niveles de saponina en el alimento para visualizar el efecto inductor. En este punto era importante determinar si los granulocitos visualizados con Sudan Black pueden ser localizados en la región intestinal de los peces alimentados con las diferentes dietas, lo que reafirmaría la influencia de los componentes de soya entregados a través de la dieta. Para ello, se recurrió al uso de la línea de pez cebra Tg(mpx:GFP)i114 que expresaba la proteína fluorescente verde (GFP) asociada a mieloperoxidasa. Esto revela la presencia de neutrófilos que expresan esta enzima mediante un ensayo de inmunohistoquímica con anticuerpos antiGFP. La figura siguiente (Fig. 3) muestra secciones representativas de peces alimentados con dieta control (3A), o con dieta high-APS (3B). La inclusión de saponina arrojó un resultado similar (no mostrado). En todas ellas se muestra que los neutrófilos están localizados (marca marrón) en las cercanías del lumen del tracto digestivo. Aunque no se realizó una cuantificación de estas marcas, estos resultados indican que los granulocitos enumerados por Sudan Black se encuentran en las cercanías del tracto digestivo, lo que sugiere que han migrado a esa zona como resultado de la estimulación provocada por los componentes de la soya.

Los resultados mostraron un aspecto novedoso, esto es que la proteína de soya a niveles de 50% de reemplazo ejerció un efecto inflamatorio potente en las larvas de pez cebra. Esto quedó demostrado con el aumento en el número de granulocitos en larvas alimentadas con dieta rica en proteína de soya (50%). Para caracterizar el efecto de la incorporación de componentes de soya en la dieta (high-SAP; high-APS), varios genes asociados al sistema inmune innato fueron ensayados por qPCR. Sus expresiones relativas fueron determinadas usando los peces alimentados con dieta control como referencia. La expresión de citoquinas tales como il1b y tnfa, fue ensayada porque estos péptidos son importantes para la iniciación y amplificación de las reacciones inflamatorias. Además, se examinaron genes relacionados con sistema inmune innato (mieloperoxidasa, mpx y lizosima, lyz). Los granulocitos más importantes corresponden a los neutrófilos, los cuales pueden ser identificados por un alto número de gránulos en su citoplasma y su actividad puede ser asociada con la expresión de mpx. Los perfiles de expresión observados en peces alimentados con elevadas inclusiones de los componentes de soya (high-SAP; high-APS), revelaron dos aspectos relevantes (Fig. 4). Primero, estas dietas indujeron la expresión de genes con reconocidas funciones proinflamatorias como il1b, tnfa, y saa, los cuales están involucrados en el reclutamiento y migración de granulocitos. Un segundo aspecto es la inducción de genes involucrados en defensa contra la infección, tales como mpx y c3b.

Los peces alimentados con high-APS exhibieron un perfil de expresión del tipo proinflamatorio. Sahlmann y cols. (2013) evaluaron una progresión de la respuesta temprana a la enteritis inducida por soya en salmón del Atlántico, usando un paralelo entre microarreglos para anailzar el transcriptoma e histología para describir las señales de enteritis. Estos autores mostraron que la inducción de genes, especialmente de aquellos relacionados con el sistema inmune, ocurre con anterioridad a la manifestación de enteritis a nivel histológico. Esto coincide con lo observado en pez cebra, donde se verificó la inducción de genes del sistema inmune y se dedujo la migración de granulocitos hacia las cercanías del tracto digestivo. Una exploración más tardía debiera revelar manifestaciones histológicas claras de enteritis en el modelo. Los resultados de Fuentes-Appelgren y cols. (2014) aportan evidencia de que la proteína de soya en la dieta puede inducir señales de inflamación (expresión génica) que se traducen en manifestaciones celulares (granulocitos). Es conocido que las proteínas de soya tienen propiedades inmunogénicas (Collins y cols. 2012) y, por otra parte, la Glicinina and b-conglicinina, son las mayores proteínas de almacenamiento y han sido consideradas como alérgenos en los alimentos. Por esa razón, varios estudios se han realizado para investigar los efectos de estas proteínas sobre el sistema inmune de diferentes modelos animales (ratones, cerdos y vacunos). Se ha descrito que la hidrólisis de estas proteínas, asociada a un proceso de fermentación de soya, reduce la inmunoreactividad del plasma en cerdos. Sin embargo, estudios realizados en trucha arcoíris sugieren que dietas conteniendo esta fracción proteica, no alteran la histología de estos peces. Esta discrepancia puede deberse a la baja inclusión en cuanto a proteínas de soya en la dieta, lo cual coincide con nuestros resultados derivados del ensayo de dietas low-APS. En contraste, los peces alimentados con saponina (high-SAP) exhibieron un perfil de expresión más asociado a una reacción antiinfección, induciéndose genes involucrados en defensa contra una infección, como mpx y c3b. La mieloperoxidasa está involucrada en la producción de compuestos bactericidas en los granulocitos. Su inducción mediante dietas high-SAP coincide con el aumento en el número de granulocitos asociados al tracto digestivo (Fig. 2). Estos resultados se pueden asociar, además, con la estimulación de saa, gen relacionado con la respuesta aguda frente a infecciones. Estos resultados pueden ser explicados por la acción de saponina sobre el tracto digestivo. El mecanismo sugerido, consiste en que la saponina incrementa la permeabilidad de la mucosa intestinal, de esta forma el sistema inmune local (pez cebra) se ve expuesto a antígenos foráneos provenientes desde el lumen del tracto digestivo, los que inducen una respuesta inflamatoria. Estos antígenos foráneos pueden ser las proteínas vegetales con potencial inmunogénico o bien, antígenos derivados de la microbiota. Esto en concordancia con lo reportado por Brugman y cols. (2009), quienes ilustraron la influencia de la microbiota en los síndromes inflamatorios del tracto digestivo de pez cebra. Estos autores emplearon oxazolona para inducir enterocolitis en pez cebra y agregaron antimicrobianos para alterar las poblaciones bacterianas de la microbiota. Aquellos peces dominados por Fusobacteria, mostraron una reducción en los índices de enterocolitis. En contraste, peces dominados por Proteobacteria presentaron una reducción en la infiltración por granulocitos, sin embargo, no redujeron los índices de enterocolitis. Esto destaca el posible rol de la microbiota como modulador de las manifestaciones de la enteritis inducida por soya.

Microbiota asociada a enteritis En el grupo de Biotecnología del INTA hemos realizado ensayos enfocados en determinar si la microbiota de salmones alimentados con dieta rica en soya muestra cambios concomitantes con la manifestación de enteritis. Los peces (Salmo salar) sometidos a dieta control (harina de pescado) y dietas vegetales (soya) fueron evaluados en tiempo de tratamiento (45 días) y la histología del intestino fue la principal prueba para revelar el progreso de la inflamación. En paralelo, para evaluar las poblaciones bacterianas en los peces tratados con las diferentes dietas, varias mediciones fueron realizadas tanto recuento de viables como por PCR cuantitativa. En la figura siguiente se observa que la carga total medida en recuentos Bact/g, no cambió significativamente en el tiempo monitoreado (Fig.5A) ya sea en dietas controles o dietas con soya.

La composición de la microbiota se analizó mediante la identificación taxonómica y la estimación de su carga. Shewanella fue el género más común y presente en todos los puntos y las dietas analizadas; su presencia fue independiente del grado de enteritis que se indujo en la dieta con soya (no mostrado). En los cambios de microbiota, el aspecto más relevante fue la desaparición de Lactococcus en concomitancia con el comienzo de las señales de inflamación (Fig. 5B). Lactococcus estuvo presente desde el inicio y durante toda la experiencia en los peces sometidos a dieta control, sin embargo, en los peces alimentados con soya, esta bacteria bajó a niveles indetectables cuando los signos de enteritis comenzaron a aparecer (Fig. 5B, Fig. 6). Estos resultados están en concordancia con otros estudios donde se describen cambios en las poblaciones bacterianas, cuando se incluyen elementos de soya en la dieta (Desai y cols. 2012). Dado que los componentes de microbiota del tipo bacterias lácticas fueron probados previamente en pez cebra y mostraron un comportamiento neutro con tendencia a una menor inducción de algunas señales inflamatorias, se optó por incluir estos microorganismos en dietas con altos contenidos de elementos vegetales, para visualizar su efecto en la enteritis en salmón. Se incluyeron estas bacterias en el mismo estudio descrito en la sección anterior, donde se comparó los parámetros histológicos descritos por Kudnsen y cols. (2008). De esta forma, se comparó cortes histológicos derivados de salmones alimentados con dieta control que sólo contenía harina de pescado versus una dieta experimental rica en soya y, la misma dieta experimental, suplementada con las bacterias lácticas (Navarrete y cols. 2013). Los parámetros histológicos se mantuvieron normales en el caso de la dieta control, en cambio, se presentaron alterados en la dieta experimental. La inclusión de bacterias lácticas produjo una reducción en los índices de enteritis, como se destaca en la Figura siguiente (Fig.6). Los resultados mostraron que la inclusión de cepas de bacterias lácticas, se traduce en disminución de la inflamación característica en este tipo de enteropatías. Esto se ilustra en la figura anterior, donde se aprecia con flechas destacadas que los días 21 y 28 de tratamiento, los niveles de inflamación (score 1-5 en eje Y), tienden a bajar en los peces que reciben dieta vegetal suplementada con bacterias lácticas.

En resumen, estos resultados indican que la saponina y la proteína de soya en la dieta, juegan un rol importante en la inducción de señales inflamatorias a nivel del tracto digestivo de los peces, que conducen a la manifestación de enteritis a nivel histológico. Estas evidencias soportan también el uso de pez cebra como un modelo para el estudio de inmunomodulación a través de la dieta, que puede ser útil para una variedad de especies de interés acuícola. En particular, se establece su utilidad en el estudio de enteritis y la inclusión de insumos vegetales, que es un tema de importancia para la acuicultura. Además, se determinó que la inclusión de bacterias de la microbiota puede reducir en parámetros de inflamación de la enteritis, en el contexto de una dieta rica en soya. Con esto se abre una oportunidad para modular las señales de inflamación a través del uso de bacterias o sus componentes, en peces sometidos a elevadas inclusiones dietarias de soya. Una interesante proyección de trabajo sería estudiar los componentes bacterianos y sus mecanismos que llevan a la reducción de señales inflamatorias. Financiamiento Fondecyt 1110253; 1140734

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