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Chile: Sergio Marshall es Ph.D. en Microbiología y Genética Molecular de la Universidad de Harvard (EE.UU.) y, actualmente, encargado del Laboratorio de Patógenos Acuícolas de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, laboratorio de referencia mundial para el virus ISA, quien explicó a Salmonexpert las razones de la reciente suspensión a cinco laboratorios para realizar diagnóstico de ISA.

Fue a mediados del año 2014, cuando el Servicio Nacional de Pesca y Acuicultura (Sernapesca) anunció que la Organización Mundial de Salud Animal (OIE) aprobó al Laboratorio de Patógenos Acuícolas de la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso (PUCV) como Laboratorio de referencia mundial para el virus de la Anemia Infecciona del Salmón (ISA).

Recientemente, el Comité de Acreditación del Instituto Nacional de Normalización (INN), aprobó la acreditación del Laboratorio de Patógenos Acuícolas bajo la norma NCh- ISO 17.025.0f 2005 “Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración”, en el Sistema Nacional de Acreditación del INN hasta el 1 de abril del 2020, cuyo alcance es la detección del virus ISA mediante RT-PCR en tiempo real basado en Snow, M. y cols. (2006) con sonda Taqman en tejidos de órganos de especies hidrobiológicas.

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Ante la reciente suspensión de varios laboratorios de diagnóstico para realizar pruebas de detección del ISAv, quisimos conocer cómo funcionan los ring test y la opinión del encargado del Laboratorio de Referencia, Dr. Sergio Marshall, sobre los recientes resultados publicados por Sernapesca.

¿En qué consiste un ring test, en el caso del virus ISA?

La OIE indica que un ring test es un estudio de colaboración con otros laboratorios en los que se utilice el mismo método documentado. Lo ideal es que estén organizados por un Laboratorio de Referencia y que incluyan muestras problema y de referencia, de composición o título no revelados, cuyos resultados sean evaluados por expertos, y con respuesta a los participantes.Dado lo anterior, y tomando en cuenta la importancia que tiene para la acuicultura nacional y el Programa Sanitario Especifico de Vigilancia y Control de la Anemia Infecciosa del Salmón (PSEVC-ISA), el actual sistema de diagnóstico utilizado para el ISAv, basado en un PCR de tiempo real, según lo publicado por Snow et al. en el 2006, es que se diseñó y desarrolló este ensayo, el cual consta de tres ejes fundamentales:

1. Evaluación de tres fases dentro del procedimiento de diagnóstico: extracción de ARN, amplificación por PCR e interpretación de los resultados. El procedimiento incluye muestras de tejido y de sobrenadantes de cultivo celular positivo y cuantificado.

2. Comparación contra dos variantes virales aisladas en Chile en diferentes años y en diferentes áreas geográficas, tales como ISAV HPR3 e ISAV HPR7b.

3. Determinación tanto sensibilidad como de especificidad al incluir en la reacción muestras positivas a patógenos vigentes y de alta prevalencia tales como Piscirickettsia salmonis y el Virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (IPNV)

Con estos ejes en mente, se planteó que el objetivo del ensayo es determinar la capacidad de los laboratorios de diagnóstico registrados por Sernapesca para detectar, mediante el uso de la metodología de diagnóstico oficial, la presencia específica del Virus de la Anemia Infecciosa del Salmón (ISAV) en muestras de tejidos de Salmónidos con diferente carga viral.La evaluación consideró un total de 30 muestras ciegas divididas en 3 lotes (A, B y C), compuestos por 10 muestras cada uno, que se desglosan de la siguiente manera:

  • 5 muestras de tejido (pool de órganos) positivas a ISAV HPR7b con diferentes cargas virales.
  • 2 muestras de tejido (pool de órganos) negativas a ISAV y una de ellas positivas a P. salmonis.
  • 2 muestras de cultivo celular preservados en Trizol LS positivas a ISAV HPR3.
  • 1 muestra de cultivo celular preservada en Trizol LS negativa a ISAV y positiva a IPNV.

Cabe mencionar que todas las muestras de ISAv fueron cuantificadas en forma relativa y cada laboratorio debió realizar el procedimiento de extracción de RNA y análisis por lotes en días o corridas diferentes, utilizando para ello su protocolo previamente establecido. En esta oportunidad, el ring test involucró dos procedimientos simultáneos: Extracción de RNA de las muestras y su amplificación específica y reproducible por qRTPCR. Esa es una razón posible para que el porcentaje de laboratorios que deberán repetir el proceso sobrepase el 10% del total.

¿Cuál (es) es (son) la (s) causa (s) más recurrente de fallas en los laboratorios que son sometidos a Ring Test y cuáles ameritan la suspensión?

Las fallas más recurrentes son los patrones de repetitividad de cada laboratorio, los cuales presentan variabilidades mayores a los recomendados teóricamente Sin embargo, se debe considerar que entre laboratorios se utilizan diferentes equipos, reactivos, volúmenes de reacción, etc., lo que amortiza esta falla.

En segundo término, ocurren fallas de sensibilidad de la técnica, lo que está asociado con las muestras con menor carga viral, lo que es esperable, y, finalmente, la falla menos recurrente es una falla de especificidad.

En términos de cuales ameritan suspensión, las dos primeras están sujetas al rango, sin embargo, la tercera es causal inmediata de suspensión.

¿Qué opinión tiene respecto de la calidad de los análisis de los laboratorios de diagnóstico en la industria?

En los últimos años, la normativa que rige el funcionamiento y requisitos de los laboratorios se ha hecho cada vez más exigente y las capacidades de Sernapesca para fiscalizar el funcionamiento de estos ha aumentado exponencialmente. Sobre todo, al considerar la implementación del sistema de calidad en base a la norma ISO 17.025 y la respectiva acreditación ante el INN, lo que garantiza la calidad de los análisis.

Ahora, no se debe olvidar que estamos trabajando en un sistema biológico extremadamente complejo y que depende de una serie de factores externos, por lo tanto, no se debe poner en tela de juicio el sistema de vigilancia producto de los resultados de este ensayo.

¿Cómo contribuye el Laboratorio de referencia, que usted dirige, en mejorar el estándar de análisis de los laboratorios de la Red de Sernapesca?

El concepto de “estándar de calidad” es una condición sine qua non en la toma de decisiones relacionadas con métodos de diagnóstico asertivos. Para ello, acreditamos el laboratorio con el INN, la instancia nacional competente, logrando la ISO 17.025. En ese contexto  generamos una imagen de excelencia validada. Por otra parte, nuestra relación con los laboratorios de la red, así como con el personal ad hoc de los centros productivos, ha sido siempre en un ámbito de ayuda y formación. De hecho, hemos generado diferentes alternativas de capacitación que ha favorecido el generar un ambiente de confianza entre las partes. Resumiendo, independiente de la estrictez que amerita el control, la gente se siente parte de él y están conscientes que es una necesidad ineludible en pos de la sustentabilidad de la salmonicultura nacional.