La caligidosis, una parasitosis que complica a la salmonicultura chilena

Aprendiendo Acuicultura es una serie de artículos destinada a quienes tienen una participación activa en la industria acuícola. Esta sección está organizada con el propósito de entregarle información que esperamos encuentre útil en su trabajo diario, pues cuanto más conocimiento tenga, mejor podrá optimizar las condiciones de los peces y, un mejor bienestar animal, conduce a un desempeño más productivo y sustentable. Quisiéramos recibir sus observaciones y comentarios acerca de esta serie y apreciaremos sus sugerencias para futuros temas que le gustaría ver abordados aquí. Por favor envíenos sus comentarios a contacto@salmonexpert.cl

La sección Aprendiendo Acuicultura está escrita y editada por Gladys Asencio, Magister en Ciencias en Ecología Marina, especialista en ecología de microcrustáceos e investigadora del Centro de Investigaciones I-Mar de la Universidad de Los Lagos. Puede contactarla en la siguiente dirección de correo electrónico: gasencio@ulagos.cl

V.- Revisión histórica de su control Este capítulo entrega una revisión de los esfuerzos desarrollados por privados, investigadores y entidades de Gobierno, para realizar una control efectivo de las especies de caligidos que impactan sanitaria y económicamente a la salmonicultura, en Chile (Caligus rogercresseyi) y el hemisferio norte (Lepeophtheirus salmonis), desde inicios de esta actividad hasta hoy. El control de los caligidos en los centros de cultivo es una actividad que se realiza para mitigar o eliminar estos ectoparásitos a través del tiempo. Las metodologías implementadas, desde inicios de la salmonicultura, involucran terapias químicas, biológicas y físicas, las que se han desarrollado acorde a los avances tecnológicos de la acuicultura mundial. Revie y col (2009) resumen las diversas estrategias adoptadas en todos los países en que se realiza salmonicultura. En la Tabla 1 se entrega un detalle de las herramientas químicas y no químicas.

En general, las primeras herramientas usadas para el control de C. rogercresseyi y L. salmonis fueron de origen químico, posteriormente, se aplicaron depredadores del parásito (en países que poseen peces limpiadores), así como cambios en las metodologías de cultivo de los salmones y truchas. Respecto del criterio de decisión para activar la aplicación de un tratamiento o estrategia de control, en la salmonicultura mundial se utiliza el número promedio de adultos totales o hembras generadoras de huevos (ovígeras), del total de peces y jaulas evaluadas por centro. Por ejemplo, en Noruega, Escocia e Irlanda, con 0,5 hembras adultas o grávidas, se inicia la aplicación de tratamientos con antiparasitarios (Revie y col., 2009). En nuestro país, se utiliza el número promedio de adultos totales, valor obtenido desde 40 peces evaluados según normativa vigente (Sernapesca, 2012). A continuación, se describe la estrategia de control utilizada en Chile en los últimos siete años, indicando los cambios y variables consideradas en la toma de decisiones.

1.- Evolución del programa de control de caligidosis en Chile 1.1.- Normativas Sernapesca. Alicia Gallardo1, Marcela Lara2 y María José Montequin3.1 Subdirectora Nacional de Acuicultura Sernapesca, Valparaíso, 2Jefa Departamento de Salud Animal Sernapesca, Valparaíso, 3Encargada PSEVC – Caligidosis Sernapesca, Valparaíso. E-mail: agallardol@sernapesca.cl Desde inicios de los cultivos de salmonídeos en Chile en los años ochenta, se introdujeron al país diversos productos químicos para eliminar esta parasitosis, entre ellos, el Neguvon (1981-1985), Nuvan (1985-2001), ivermectina (1989-2003) y peróxido de hidrógeno. A partir de 1999 se iniciaron las terapias con un solo producto, denominado benzoato de emamectina, el que perdió su efectividad a partir del 2006, incrementando la caligidosis a niveles que causaron una gran emergencia sanitaria en la industria. A partir de esto, Sernapesca incluyó a esta enfermedad en el listado de enfermedades tipo 2, iniciando el 2007 la implementación de la estrategia de control de C. rogercresseyi, con la creación del Programa Sanitario Específico de Control de Caligidosis (Etapa I), establecido según Res. Ex. N° 1883. Este programa tuvo como principales objetivos la disminución de la abundancia invernal del parásito, a través de una estrategia de tratamiento coordinado por zona; prevenir brotes de caligidosis durante el verano siguiente; contribuir a la contención del brote de Anemia Infecciosa del Salmón, a través del control de este posible vector; y mejorar el estatus sanitario general y el bienestar de los salmónidos afectados por esta parasitosis. La estrategia de tratamiento coordinado por zona implicó la realización de tratamientos antiparasitarios de acuerdo con un Plan establecido por el Servicio, considerando el respaldo de la aplicación del tratamiento a través del informe de un médico veterinario, el uso de piretroides mediante baños y la capacitación del personal encargado de realizar los tratamientos. Posteriormente, el Programa de Control citado anteriormente se fusionó con el Programa de Vigilancia establecido según Res. Ex. N° 1789 el año 2007, originando el Programa Sanitario Específico de Vigilancia y Control de Caligidosis (PSEVC), establecido según Res. Ex. N° 2117 del 2009 (Sernapesca, 2009). Las medidas instauradas dentro del programa en relación al control de caligidosis se basaron en el manejo sanitario por área, en las cuales el Servicio estableció la coordinación de los períodos de siembra, cosecha y descanso para los centros de cultivo incluidos en el área. Adicional a lo anterior, se estableció la realización de tratamientos antiparasitarios de forma coordinada por subzonas o Áreas de Manejo Sanitario (AMS), utilizando productos farmacéuticos mediante administración oral o por inmersión, bajo prescripción médico veterinaria y cumpliendo los protocolos e indicaciones técnicas establecidas por el laboratorio fabricante. Se estableció que los tratamientos debían realizarse a través de ventanas o intervalos de tiempo para cada AMS, considerando para los tratamientos administrados por inmersión intervalos mínimos entre ventanas en base a la duración del ciclo de vida del parásito y la temperatura del agua. En las AMS se determinó como nivel de acción el valor de 6 caligus juveniles y 6 caligus adultos totales, es decir, aquellos centros que presentaban cargas iguales o superiores a este nivel debían obligatoriamente realizar tratamiento contra Caligus, dependiendo del estadío que se encontrara elevado, según lo indicado en Tabla 2.

Sin perjuicio de lo anterior, el Servicio estableció un nivel de acción más exigente para aquellas AMS que, sobre la base de criterios técnicos como cargas parasitarias históricas, biomasa de cultivo, presencia de especies susceptibles, presencia de viveros, entre otros, se determinaron como de mayor riesgo. En dichas AMS, se estableció el siguiente nivel de acción (Tabla 3):

En conjunto a las medidas citadas anteriormente, se estableció la obligatoriedad de notificar con antelación la ejecución de los tratamientos antiparasitarios, contar con la presencia de un profesional acreditado por el Servicio al momento de su realización e informar la eficacia del mismo. En el año 2012, el Servicio implementó una nueva estrategia en el control de C. rogercresseyi, establecida según Res. Ex. N° 1141 (Sernapesca, 2012). La estrategia de control de este programa, actualmente vigente, considera la aplicación de medidas oportunas y coordinadas ante la detección de Centros de Alta Diseminación (CAD), es decir, centros que presentan una carga semanal ≥ 9 caligus adultos totales. Una vez detectado un centro CAD, se establece una zonificación, denominada zona infectada, que comprende de forma precautoria un radio de 5 millas náuticas. Para los centros de cultivo ubicados en la zona infectada, se establece un nivel de acción de 6 caligus adultos totales, por lo tanto, aquellos centros con abundancia igual o superior deben realizar tratamiento obligatorio dentro de la próxima ventana de tratamiento. Se establece la obligatoriedad de emplear sistemas cerrados de tratamiento por inmersión (lona/wellboat), medidas que, desde el lanzamiento del Programa, fueron implementadas en forma gradual según las cargas históricas de Caligus en cada agrupación y cuyo plazo final se cumplió en el mes de junio del año 2013. Además de lo anterior, con la finalidad de aumentar la eficacia de los tratamientos y prevenir la reinfestación en los centros de cultivo, se determinó que los tratamientos antiparasitarios administrados por inmersión deberían ejecutarse dentro de un período máximo de duración de siete días. Finalmente, aquellos Centros de Alta Diseminación, que dentro de su período de evaluación de seis semanas, hubieren presentado tres monitoreos semanales con cargas parasitarias ≥ 9 caligus adultos totales, quedarán afectos a la medida de cosecha anticipada de la biomasa infestada. En la Fig. 1 se puede apreciar la evolución de las cargas parasitarias, biomasa y los productos antiparasitarios, junto con los Programas de Control de Caligidosis establecidos por el Servicio en estos siete años. Los caligus han reducido sus cargas en los centros al aplicar los tratamientos antiparasitarios, aunque los niveles permanecen en una condición que provoca emergencias como las observadas durante el verano del 2009 y otoño del 2013. Esto ha llevado a implementar desde el 2009 el uso de un número mayor de productos antiparasitarios con poder activo diferente a las avermectinas y piretroides, los que actúan principalmente en el control de la diseminación de la enfermedad. Actualmente, y debido a la disponibilidad de antiparasitarios de cuatro principios activos, el Servicio Nacional de Pesca y Acuicultura está en proceso de modificación del Programa Sanitario actual, el cual tendrá como principal foco de control, la rotación de principios activos administrados por inmersión y la coordinación de los tratamientos por macrozonas.

1.2.- Programas de empresas privadas Intesal S.A., mediante Caligus on line, recopila los reportes semanales de caligidosis del 100% de los centros de cultivo en actividad, integrando la información en mapas (Fig. 2) y boletines por estadio del parásito. Además, entrega el número y tipo de tratamiento que se realiza en la semana de reporte (Asencio y col., 2011). Junto a esto, según comentó Rolando Ibarra, encargado del área sanitaria de esta empresa, Intesal desarrolla diversas líneas de investigación y difusión para apoyar a las empresas salmonicultoras en el manejo de esta enfermedad, contando con la colaboración de la UACh, INCAR, UPEI, AVS, entre otros. Entre los estudios en ejecución se encuentran: línea base de la sensibilidad del Caligus a distintos antiparasitarios a nivel de macrozonas; efecto de la coordinación sobre el éxito terapéutico; evolución del éxito terapéutico a los distintos antiparasitarios; determinación de los umbrales de producción basado en indicadores sanitarios, entre ellos caligus; levantamiento de los efectos del peróxido de hidrógeno sobre el ambiente; bioeconomía de Caligus en Chile; determinación de las fuentes de sea lice en Chile y modelo epidemiológico de dispersión de larvas; buenas prácticas en el uso de baños con lona cerrada; y buenas prácticas en el uso de baño en wellboats. En términos regulatorios, participan activamente en la discusión de la normativa sanitaria que involucra la vigilancia y control de caligus. En términos ambientales, toman parte de la mesa de trabajo con la autoridad sectorial (Sernapesca, marítima, ISP, etc.) para prevenir y mitigar los eventuales efectos ambientales y de seguridad ocupacional de los tratamientos. Por último, en términos de inocuidad alimentaria, integran en conjunto con la autoridad y productores una mesa de trabajo que se preocupa de velar por la inocuidad y seguridad en la producción de alimentos. Aquabench S.A., empresa dedicada al análisis y asesorías en rubros acuícolas, desde mayo del 2013 inició un proyecto con más del 85% de las empresas salmonicultoras, con el objetivo de recopilar y analizar los reportes semanales de caligidosis, así como apoyar en la implementación de los tratamientos coordinados entre centros para cada macrozona en actividad. Daniel Woywood, gerente técnico de esta empresa, detalló que esta actividad se inició con dos macrozonas y actualmente involucra a las ocho macrozonas de las regiones de Los Lagos y Aysén. Los resultados del trabajo coordinado entre las diferentes empresas salmonicultoras, tarea a la que se ha abocado Aquabench y un comité de expertos que los acompaña, han permitido plantear modificaciones en la estrategia de control de esta parasitosis, las que se han puesto en marcha durante el 2014 y en un futuro próximo pretenden ser incluidas en el Programa Sanitario implementado por Sernapesca. Entre las medidas están: a) la rotación de fármacos de diferente poder activo, b) la coordinación de tratamientos por cargas de hembras ovígeras, c) el nivel de acción para un tratamiento es de 1,5 hembras ovígeras.

2.- Metodologías de control 2.1.- Farmacológicas Entre los productos utilizados para el control de la caligidosis, se encuentran desinfectantes como el peróxido de hidrógeno y antiparasitarios orales o de inmersión. En la Tabla 3, se detallan los diferentes antiparasitarios autorizados actualmente por el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) en nuestro país, las dosis y tiempo de aplicación, así como su carencia y poder activo. Los nueve productos pertenecen a cuatro poderes activos (organofosforado, piretroide, benzoilurea y avermectina), cuya acción frente a los caligidos está focalizada principalmente en impactar el sistema nervioso del parásito, con excepción de la benzoilurea (diflubenzuron) que limita la formación de quitina. De la totalidad de productos comerciales, cuatro son aplicados mediante baños a los peces (Alphamax, Deltametrina 1%, Betamax y Salmosan), garantizando la reducción de los adultos del parásito. En tanto que los cinco productos orales (cuatro conformados por benzoato de emamectina y Calishot por diflubenzuron) son entregados en el alimento, como terapias de varios días para juveniles. Aun cuando se ha registrado en C. rogercresseyi la disminución de su sensibilidad frente al benzoato de emamectina (Bravo y col, 2008), éste sigue aplicándose en los centros durante los primeros meses de engorda en mar. La estrategia de control implementada durante los siete años de vigencia del PSEVC, se ha centralizado en la aplicación de tratamientos para reducir las cargas de adultos de caligus, por lo que los baños con piretroides y organofosforados forman parte de las actividades más frecuentes en los centros de cultivo. A continuación, se detallan las metodologías utilizadas en estos tratamientos, así como las pruebas realizadas por algunos laboratorios para determinar la sensibilidad y resistencia de C. rogercresseyi a dichos fármacos.

2.1.1.- Implementación de los tratamientos por inmersión A partir del ingreso a Chile de los antiparasitarios por inmersión, deltametrina, cipermetrina y azametifos, se iniciaron las implementaciones en los centros de cultivo de las metodologías para bañar los peces al interior de las jaulas o en wellboats. Asencio y col. (2013) resumen los resultados de un estudio desarrollado entre el 2011 y 2012, financiado por Sernapesca, en donde se analizaron un total de 78 tratamientos realizados con piretroides. En las Fig. 3 y 4 se muestran las instalaciones de los faldones, sistemas de cierre utilizados entre el 2007 y el 2012, la incorporación de los sistemas de distribución del fármaco, y la dilución en recipientes con agua de mar previo a su distribución Los resultados del estudio demostraron falencias en diversas fases de la aplicación de los tratamientos, destacando 1) la alta variabilidad de sistemas de distribución utilizados (en Fig. 3 ejemplos de tubo circular, cuadrado y manifold); 2) la incorporación de agua desde el fondo de las jaulas; 3) diversos tiempos de exposición; 4) diversos tiempos de incorporación; 5) materiales en mal estado; y 6) personal encargado con escasa capacitación, entre los más relevantes. Posterior a este estudio, Sernapesca realizó modificaciones en la normativa del Programa de control, exigiendo a partir del 2012 la incorporación de lonas cerradas para reemplazar los faldones, corrigiendo con ello una de las variables que incidió en la variabilidad de la eficacia de los piretroides. Junto a esto, las empresas salmonicultoras, farmacéuticas y laboratorios, iniciaron diversos estudios para cuantificar la concentración efectiva del producto al interior de las jaulas, y caracterizar las variables determinantes de sus fluctuaciones. Una de estas empresas es AVS Chile, a continuación se resumen las diversas actividades que esta empresa ha desarrollado en estos temas en los últimos siete años.

Javier Unibazo, Joaquín Aurtenechea, Mary Ann Hausdorf, Claudia Venegas, Øyvind Knutsen y Dag Slagstad, AVS Chile/Sintef F&A. mary.hausdorf@avs-chile.cl Con el objetivo de apoyar la investigación y generación de conocimiento en torno a diversos temas de la cadena productiva del salmón en Chile y, puntualmente, en respuesta a la necesidad de generar e implementar herramientas para la prevención y el control de Caligus en Chile, AVS se ha focalizado en detectar las necesidades específicas y generar proyectos de I+D orientados a apoyar a la industria en el desarrollo de herramientas que contribuyan al manejo integrado para el control del parásito. Las actividades desarrolladas en los siete años de operación comprenden la modelación oceanográfica de la dispersión de C. rogercresseyi, formulación de estrategias de control, evaluación de eficacia de los antiparasitarios y diseño de manuales de buenas prácticas para mejorar las metodologías de baños. Modelación oceanográfica, Sinmod. Sinmod es un modelo hidrodinámico en 3D desarrollado por Sintef F&A y en él las partículas que representan a Caligus y los virus fluyen libremente con las corrientes. Contempla un componente conductual para Caligus que le permite desplegar un comportamiento natatorio vertical para el parásito, modulado por la profundidad, la salinidad y su ciclo de vida. Este modelo fue aplicado en el mar interior de Chiloé, en los barrios 9 y 10, en donde se trabajó con 102 centros de cultivo. Tras calcular el recorrido de todas las partículas, se utilizó la fracción relativa de aquellas que, desde un sitio, afectan a otros. Los resultados de la modelación muestran el porcentaje de transferencia de infección entre los sitios, representado en una amigable e innovadora interfase web en donde los productores pueden simular distintos escenarios de infección. La iniciativa, replicable en otras zonas donde se desarrolla la acuicultura, fue el resultado de un proyecto desarrollado por AVS Chile con ocho empresas productoras de salmón, orientado a favorecer la toma de decisiones estratégicas de las compañías en torno a la gestión de las áreas de cultivo. Actualmente, AVS Chile se encuentra comenzado un nuevo proyecto que busca los mismos objetivos, pero en los barrios 18 ,19 y 20, en donde interactuarán alrededor de 200 centros de cultivos pertenecientes a nueve empresas productoras.

Diseño y evaluación de la efectividad de estrategias integradas para el control de C. rogercresseyi El proyecto es financiado por el Fondo de Investigación Pesquero, con contraparte técnica de la Subsecretaria de Pesca y Acuicultura. El objetivo es evaluar la efectividad de diferentes estrategias farmacológicas integradas para el control de C. rogercresseyi en salmónidos, incluyendo antecedentes oceanográficos en la macrozona establecida. Dentro del plan de trabajo se considera el levantamiento de información epidemiológica y de efectividad de tratamientos, tanto a nivel nacional como internacional. Además, se recopila información oceanográfica y condiciones medioambientales de la macrozona en estudio, la cual será utilizada para alimentar el modelo de simulación oceanográfica (Sinmod). A partir de la información obtenida, se diseñarán y evaluarán diferentes estrategias farmacológicas integradas para el control de Caligus. El proyecto finalizará con un protocolo de tratamiento coordinado y un modelo o metodología para evaluar la efectividad de tratamientos. El proyecto cuenta con la colaboración del Norwegian Veterinary Institute, Norwegian Food Safety Authority, Sintef F&A y Cetecsal. Evaluaciones de riesgo ambiental y eficacia de fármacos antiparasitarios bajo condiciones productivas: apoyo en el registro de productos farmacéuticos. Las investigaciones, realizadas para distintos laboratorios farmacéuticos, se han basado en Evaluaciones de Riesgo Ambiental (ERA) de productos médico veterinarios utilizados contra Caligus bajo condiciones de campo. Los estudios consideran la determinación de concentración de químicos en columna de agua, fondo marino y efectos sobre la diversidad y abundancia de macrofauna bentónica. Asimismo, se han realizado evaluaciones de eficacia de los fármacos en terreno, considerando el porcentaje de reducción de carga de los diferentes estadios del parásito.

Manuales de buenas prácticas para mejorar la operación de los baños terapéuticos en jaula con lona cerrada y wellboat El baño terapéutico en jaula con lona cerrada es una técnica común utilizada para controlar Caligus en Chile. Desde el año 2013, el Servicio Nacional de Pesca y Acuicultura indica que todos los tratamientos por inmersión deben ser realizados en sistemas cerrados (lona y/o wellboat). En ese momento, la metodología requerida para realizar tratamientos eficaces de baños con lona cerrada no estaba bien definida y la tecnología utilizada no era específica en cuanto al manejo de materiales y equipamiento involucrado. El objetivo del proyecto fue generar y transferir el conocimiento necesario para reducir las brechas tecnológicas y operacionales identificadas para este tipo de tratamientos. Se organizó un comité técnico, conformado por productores de salmón, proveedores de equipos y materiales, y expertos en las áreas de salud animal, ingeniería y operaciones. Basándose en observaciones en terreno de los baños terapéuticos, el comité técnico analizó y discutió las prácticas actuales, identificando las brechas operacionales y tecnológicas. Los resultados arrojaron los puntos importantes a ser considerados antes de llevar a cabo el tratamiento tales como: (1) características de las jaulas; (2) condiciones medioambientales; (3) condiciones productivas y de salud de peces; y (4) disponibilidad de materiales y staff requeridos. Además, se identificaron seis pasos críticos de la operación: (1) soltar y levantar la red pecera; (2) sistema de oxigenación y monitoreo; (3) instalación de la lona; (4) preparación, distribución del fármaco y tratamiento; (5) retiro de la lona; y (6) observación de los peces e intercambio de agua. Los procedimientos operacionales y recomendaciones fueron presentados a la industria a través de un manual interactivo de buenas prácticas. El proyecto concluyó que las brechas operacionales y tecnológicas se pueden identificar y minimizar a través de la generación del conocimiento requerido. Al finalizar el proyecto se detectó la necesidad de generar conocimiento en torno a la operación de baños terapéuticos en wellboat, por lo que en la actualidad se está desarrollando un estudio con objetivos y metodología similares al proyecto mencionado anteriormente, con el fin de detectar brechas operativas y tecnológicas, y generar recomendaciones para lograr un baño más eficiente y seguro, tanto para el personal como en términos de bienestar animal.

2.1.2.- Análisis in vitro de sensibilidad La evaluación de la sensibilidad de C. rogercresseyi a los diferentes fármacos en uso es una actividad que desarrollan varios laboratorios de nuestro país, a continuación se presentan las descripciones y resultados de investigaciones que han realizado tres de ellos.

Sandra Marín. Laboratorio de Interacciones Ecológicas del Instituto de Acuicultura de la Universidad Austral de Chile, Pelluco, Puerto Montt. E-mail: smarin@uach.cl La efectividad de los medicamentos que se usan para controlar el parásito C. rogercresseyi de salmónidos en Chile puede cambiar en el tiempo debido a la pérdida de sensibilidad de los parásitos a los medicamentos. Una de las principales razones de la pérdida de sensibilidad es el uso frecuente y/ prolongado de un mismo principio activo (Denholm y col., 2002). Sin embargo, es difícil saber cuánto es muy frecuente, o cuánto es muy prolongado. Por esto es necesario alternar los principios activos y llevar un monitoreo de la sensibilidad del parásito. El monitoreo de sensibilidad permite detectar cambios en esta característica y tomar las decisiones que sean pertinentes para evitar una reducción de la sensibilidad, al punto que los tratamientos dejen de ser efectivos (Whyte y col., 2013). Para monitorear la sensibilidad de los parásitos, se utiliza la aproximación de los bioensayos ecotoxicológicos, a través de los cuales se expone un grupo de organismos a un gradiente creciente de concentraciones de un compuesto tóxico (en este caso, el medicamento) y se evalúa la respuesta del grupo de organismos. La respuesta a evaluar puede ser letal o no letal. A partir de este análisis, se obtienen las curvas concentración–respuesta desde las cuales se estima la concentración que mata al 50% de los individuos expuestos al compuesto (CL50), o la concentración que afecta al 50% de los individuos (CE50). (Sevatdal y Horsberg, 2003). La realización de estos análisis para cada uno de los medicamentos utilizados en el control del parásito C. rogercresseyi y la comparación de los resultados en el tiempo para cada medicamento, nos permite detectar cambios en la sensibilidad del parásito (Fig. 6). Asimismo, comparar los valores de estos parámetros entre poblaciones del parásito de diferentes áreas geográficas nos permite determinar si existen diferencias en la respuesta del parásito al medicamento entre poblaciones. Este tipo de análisis, llevado a cabo en el marco de un monitoreo, nos permite tomar decisiones mejor fundamentadas en lo que se refiere al uso y rotación de medicamentos.

En el Laboratorio de Interacciones Ecológicas del Instituto de Acuicultura de la Universidad Austral de Chile, sede Puerto Montt, llevamos a cabo estos análisis a partir de una serie de colaboraciones con las empresas productoras de salmónidos, proveedores de medicamentos para el control del parásito y otras instituciones que realizan investigación asociada a la salmonicultura. A modo de ejemplo sobre el uso de este análisis, la Figura 7 muestra la concentración efectiva y letal obtenida desde bioensayos realizados con parásitos colectados desde salmón Atlántico en las regiones de Los Lagos y Aysén en el periodo 2007-2010, para evaluar sensibilidad al benzoato de emamectina. Esta figura indica que, aunque no había diferencias en la concentración efectiva entre parásitos de la región de Los Lagos y Aysén, si existían diferencias significativas en la concentración letal (Prueba de Mann Whitney, p<0,05). Estos resultados sugieren que concentraciones más bajas de benzoato de emamectina en Aysén que en la región de Los Lagos, lograban matar el 50% de los individuos. Este tipo de información se puede usar para que los proveedores de antiparasitarios realicen evaluaciones en el tiempo de sus medicamentos y las empresas productoras pueden tomar decisiones sobre cuáles y cómo usar los diferentes medicamentos que hoy se encuentran disponibles. Junto con los bioensayos de sensibilidad, en este laboratorio se implementó la técnica del rojo neutro, para definir la condición de vivos, muertos y moribundos, en los machos y hembras de C. rogercresseyi utilizados en los bioensayos. Esto fue parte de una tesis de Ingeniería en Acuicultura, la que permitió apoyar con excelentes resultados las observaciones con lupa estereoscópica (Barría, 2012). Los organismos vivos logran teñirse de un color rojo intenso, los moribundos de un rojo pálido y los muertos con leve tinción de la cutícula externa (Fig. 8).

Juan Pablo Cumillaf, Cristian Sayeg, Andrea Peña y Jorge Mancilla. Laboratorio Central Marine Harvest Chile, Chinquihue, Puerto Montt. E-mail: jorge.mancilla@marineharvest.com Dentro de sus unidades, el Laboratorio Central de Marine Harvest Chile cuenta desde el año 2012 con la Unidad de Caligus, la que ha implementado y estandarizado procedimientos de bioensayo in vitro para la evaluación de sensibilidad de Caligus frente a quimioterapéuticos, además de prestar servicio de vigilancia ambiental en columna de agua a través de recuentos de larvas de este parásito. Esta unidad ha mantenido monitoreos constantes de la evolución de sensibilidad de C. rogercresseyi a los diferentes quimioterapéuticos, así como de las cantidades de larvas de ectoparásitos en las cercanías de los centros productivos. Con la metodología de bioensayo, basada en la estimación del parámetro CE50 (concentración efectiva a la cual el 50% de los organismos se observan afectados) y el porcentaje de afectados en la concentración recomendada por el fabricante, podemos determinar la sensibilidad de cáligus a distintos quimioterapéuticos y diferentes modos de acción (MoA) y también cómo la sensibilidad varía temporal y espacialmente. En este contexto, se ha podido identificar zonas diferencialmente sensibles a los quimioterapéuticos (cipermetrina, deltametrina, azametifos y benzoato de emamectina). Además, esta herramienta permitiría evaluar el desempeño de un producto, ya que se puede establecer una correlación entre la eficacia del quimioterapéutico in vitro y la eficacia observada en terreno. Finalmente, se puede concluir que esta herramienta de laboratorio puede ser utilizada como una herramienta de apoyo en la toma de decisiones respecto del uso y rotación de antiparasitarios en el marco del plan estratégico de vigilancia y control de la caligidosis y, de esta forma, permitir avanzar en un siguiente nivel del manejo integrado de la enfermedad, a través de la vigilancia de la sensibilidad y resistencia de C. rogercresseyi. La verificación de los resultados de sensibilidad pre-tratamiento con un quimioterapéutico versus los resultados obtenidos de eficacia post-tratamiento con el mismo producto en terreno es considerado como una validación funcional del método (FAO, 2004). Establecer tales comparaciones o correlaciones son antecedentes valiosos de la capacidad predictiva del método de bioensayo in vitro. A modo de ejemplo, en la evaluación con cipermetrina durante el año 2014, se ha observado una correlación positiva entre las respuesta de sensibilidad en laboratorio versus terreno post-tratamiento con un R2 de 0,88, lo que quiere decir que un 88% de los valores están explicados por la correlación

Los resultados preliminares con azametifos muestran que a pesar de obtener, por bioensayos, el 100% de los parásitos afectados en la concentracion recomendada (100ppb) y muy cercana a 100% en terreno, se ha observado un aumento del CE50, al comparar valores de este parámetro en centros de cultivo en diferentes periodos del ciclo productivo, esto significaría que los parásitos están menos sensibles que al comienzo del uso de este producto en el año 2013. No obstante, los niveles de sensibilidad reducida aún son bajos, pero puede ser la primera alerta temprana de una pérdida paulatina de la sensibilidad. Por lo tanto, es de gran relevancia ampliar y establecer la vigilancia regular de la sensibilidad como parte del Programa Oficial de Vigilancia y Control de caligus. La Unidad de Caligus del Laboratorio Central de Marine Harvest está trabajando para establecer un mapa de la sensibilidad temporal y espacial, debido a que son los indicios de la “síntesis evolutiva moderna” de C. rogercresseyi frente al uso de quimioterapéuticos en la industria, y su evaluación temprana, podría ayudar a prolongar la vida útil del producto y mantener bajo los niveles gatillantes la población de parásitos, para evitar pérdidas económicas y de calidad ambiental por uso ineficiente de los productos.

Gladys Asencio, Cristóbal Levicoy y Silvana Chávez. Laboratorio de Biología, I-Mar, Centro de Investigación y Desarrollo de Recursos de Ambientes Costeros, Universidad de Los Lagos, Puerto Montt. Desde el 2005, en los laboratorios del centro I-Mar se iniciaron las actividades de dos proyectos Fondef, con los objetivos de apoyar en la formulación de un cebo y una trampa para Caligus. Los ensayos in vitro en placas de Petri fueron parte de los desafíos implementados para determinar los compuestos atractantes para los distintos estadíos de este parásito. Posteriormente, por requerimientos de empresas salmonicultoras y farmacéuticas, se realizaron diversos estudios para evaluar la sensibilidad de Caligus a diversos productos antiparasitarios. En la Fig. 10 se muestra la recolección de los parásitos desde los peces, primera tarea en el protocolo de ensayo, posteriormente, éstos son trasladados al laboratorio, donde son mantenidos al interior de cámaras de incubación con las condiciones ambientales (temperatura, salinidad y oxígeno) óptimas para su cultivo. Finalmente se preparan las placas de Petri con las concentraciones del producto a evaluar, y se incorporan los Caligus por el tiempo requerido. Al concluir el tiempo de exposición, se revisan con ayuda de una lupa estereoscópica, los caligus vivos, muertos y moribundos. Este protocolo es una adaptación al descrito en el Handbook de resistencia del sea lice a los quimioterapéuticos (Search, 2006). Los resultados de 45 ensayos con piretroides (deltametrina) realizados durante los últimos siete años (2007-2014), entregan evidencias de diferencias en la sensibilidad de C. rogercresseyi a este poder activo, registrándose 100% de mortalidad en los desafíos efectuados entre el 2007 y 2009, y una preocupante disminución de la sensibilidad desde el 2012 a la fecha, entre un 64 y 85% para centros de las regiones de Los Lagos y Aysén (Fig. 11).

2.1.3.- Resistencia a antiparasitarios La resistencia es un proceso genético que se desencadena en la mayoría de los organismos vivos por la exposición prolongada a compuestos químicos. Para los calígidos del hemisferio norte, se ha descrito resistencia al benzoato de emamectica, deltametrina, cipermetrina, azametifos y peróxido de hidrógeno (Horsberg, 2013; Helgesen y col., 2014). En la Fig. 12 se representa la forma en que se produce la selección de parásitos resistentes a un antiparasitario, ocurriendo por la sobrevivencia de un individuo resistente (color rojo en Fig. 12), el que al reproducirse incrementa el número en la siguiente generación, y así sucesivamente, hasta transformarse en una población resistente a ese producto. En Chile, la Dra. Sandra Bravo, Investigadora del Instituto de Acuicultura de la UACh en Puerto Montt, analizó entre los años 2004 y 2007 la condición de resistencia de C. rogercresseyi a antiparasitarios, a través del proyecto financiado por Fondef D04I1255. Este estudio se denominó “Evaluación de resistencia al benzoato de emamectina en Caligus rogercresseyi e implementación de estrategias para minimizar su impacto en salmones de cultivo”. Los resultados de esta investigación demostraron la reducción de la sensibilidad en Caligus a dicho antiparasitario, evaluando 18 sitios de la Región de Los Lagos (Bravo y col., 2008). Junto con esto, se diseñaron protocolos para evaluar la sensibilidad en condiciones de laboratorio, metodología descrita por Sandra Marín en el capítulo precedente y similar a la señalada por el consorcio Search (2006) en su Manual de Manejo de la Resistencia. Actualmente, el Dr. Juan Guillermo Cárcamo del Laboratorio de Bioquímica Farmacológica de la Facultad de Ciencias de la Universidad Austral de Chile en Valdivia, a través de los proyectos de investigación, Fondecyt 1120903 y Fondef D10I1128, está realizando avances en la identificación de las proteínas que están involucradas en la resistencia farmacológica observada en la caligidosis (Cárcamo y col., 2011) y trabaja en el desarrollo de suplementos orales de origen vegetal capaces de revertir la resistencia farmacológica de Caligus, permitiendo con ello aumentar la eficacia de los tratamientos farmacológicos convencionales (emamectina, deltametrina y diflubenzuron).

2.2.- Otras metodologías Hoy en día, en Chile y el extranjero, se realizan diversas pruebas de variadas metodologías biológicas, químicas y físicas, en la búsqueda de nuevas herramientas para el control de esta parasitosis. Entre ellas, vacunas, productos de origen vegetal y animal, baños térmicos o de agua dulce, ultrasonido, electrólisis, magnetismo, ultravioleta, equipos láser, barreras con lona y mallas planctónicas, depredadores de los estadios planctónicos y parásitos. Detalle de estas alternativas, sus fundamentos y resultados se presentaran en el siguiente artículo de esta serie Aprendiendo Acuicultura.

3.- Eficacia de los antiparasitarios La eficacia de los productos antiparasitarios por inmersión utilizados para el control de la caligidosis es evaluada por los muestreadores calificados de cada centro, para lo cual revisan la carga de adultos totales (AT) un día previo a aplicar el tratamiento (pre-tratamiento) y tres días posteriores al baño (post-tratamiento) de las jaulas evaluadas previamente. La normativa vigente del PSEVC, establece que la metodología de muestreo es similar a la de todos los monitoreos de caligidosis, considerando diez peces por jaula en las primeras cuatro jaulas a ser tratadas. El porcentaje de eficacia se calcula según la fórmula:

El análisis histórico de los resultados de eficacia de los tratamientos realizados desde la incorporación de los piretroides y organofosforados al programa de control de Caligus evidencia altos porcentajes de mortalidad de los adultos durante los primeros años de uso de cada producto, con disminución posterior a la utilización permanente por varios años. Asencio y col. (2011) en la evaluación de los registros de datos del programa Intesal, desde el 2007 al 2009, muestran que el 2008 se realizaron un total de 1.170 baños con Alphamax, y el 2009 el valor se redujo a 140, con resultados exitosos (cercanos a 100%) para la disminución de los adultos. Posteriormente, durante las observaciones de eficacia de los 78 tratamientos realizadas en los veranos del 2011 y 2012, Asencio y Riquelme (2013), en informe entregado a Sernapesca, señalan que las eficacias fluctuaron de 0 a 83% para deltametrina y 0 a 97% en cipermetrina, relacionando la dispersión de resultados con los problemas metodológicos durante la aplicación de los fármacos en los centros. Sin embargo, se debe tener presente que durante esos cinco años se utilizaron las mismas metodologías para aplicar los baños, por lo que la variabilidad en eficacias entre el 2008 y 2012 también puede deberse a respuestas del parásito al perder sensibilidad a estos productos. Durante el 2013, se incorporó al azametifos como tratamiento para el control de la diseminación de Caligus, permitiéndose terapias de dos baños consecutivos con este producto y obligatoriedad de cambio de poder activo para el siguiente tratamiento. En la Fig. 13 se representan los resultados de las eficacias de los tratamientos realizados con este nuevo fármaco y los dos piretroides, para la primavera 2013 y verano 2014. Para este período, la deltametrina exhibe las menores eficacias, sin superar el 70% en promedio para cada mes, La cipermetrina y el azametifos superan el 60% de mortalidad de adultos, transformándose el organofosforado en el mejor producto para el control de este parásito, razón por la que se está usando frecuentemente.

Los productos orales, diflubenzuron y benzoato de emamectina, son utilizados esporádicamente como alternativas en las estrategias de control que han adoptado las empresas salmonicultoras, por ello no existen seguimientos de sus eficacias como las que se desarrollan para los tratamientos por inmersión. Sin embargo, al ser terapias que permiten disminuir las cargas de juveniles, éstas deben ser consideradas como complementarias en las estrategias que se adoptan en los centros de cultivo. Se plantea mantener la vigilancia permanente de la sensibilidad de C. rogercresseyi a cada uno de estos fármacos, ya que la reducción en la eficacia detectada para los piretroides a los siete años de aplicación continua, puede ser la primera evidencia de resistencia, similar a lo registrado el 2006 para el benzoato de e9mamectina (Bravo y col., 2008).

4.- Resumen En este artículo se presentó una revisión histórica de las metodologías implementadas para realizar el control de la caligidosis en los centros de cultivo, desde inicios de la salmonicultura en el país y el extranjero. También se describió el Programa Sanitario de Control implementado por el Servicio Nacional de Pesca y Acuicultura, junto a empresas como Intesal S.A. y Aquabench S.A., los que han permitido reducir en los últimos años las emergencias sanitarias provocadas por esta parasitosis. La estrategia aplicada en los últimos dos años, basada prioritariamente en el uso coordinado de antiparasitarios que mitigan la diseminación de caligus, mantiene las cargas de parásitos en valores inferiores a 50 caligus por pez. En consecuencia, la enfermedad permanece presente en la mayoría de los centros, obligando a la aplicación permanente de tratamientos durante todo el ciclo productivo. El mejoramiento de las condiciones en las que se han implementado los tratamientos por inmersión, son parte de los desafíos a los que se ha visto enfrentada la industria para obtener mayor eficacia de los fármacos, así como mantener una vigilancia constante de la sensibilidad y resistencia del parásito a cada producto y, a la vez, desarrollar terapias alternadas y combinadas para evitar la aparición de resistencia. En conclusión, el control de la caligidosis es una actividad en constante perfeccionamiento, permitiendo con ello adaptarse a los cambios de la industria salmonicultora y del parásito. En el próximo capítulo de esta serie Aprendiendo Acuicultura se describirán las nuevas metodologías y estrategias de control de esta enfermedad, con énfasis en la búsqueda de un plan integrado de manejo.

5.- Literatura citada Asencio G. 2013. Proyecto I-Mar/Sernapesca: Fortalecimiento del esquema de vigilancia y control de la caligidosis en centros de cultivo de la X y XI región. Octubre 2012-Marzo 2013. Asencio G, Riquelme V. 2013. Análisis histórico de las estrategias de vigilancia y control de la caligidosis en la salmonicultura chilena. SalmonXpert 1: 43-49. Asencio G, Marín S, Miranda P, Ibarra R. 2011. La Caligidosis en salmónidos de cultivo; resultados del programa de monitoreo, vigilancia y control de Caligus rogercresseyi de Intesal. Período octubre 2007-diciembre 2009. Compendio Intesal. Barría P. 2012. Utilización de la técnica de tinción de rojo neutro para la categorización de la condición de vivo-moribundo-muerto de Caligus rogercresseyi (Boxshall & Bravo, 2000)(Copepoda:Caligidae) en bioensayos de sensibilidad a los antiparasitarios. Tesis de Ingeniero en Acuicultura. Universidad Austral de Chile. 56 pp. Bravo S, Sevatdal S, Horsberg T. 2008. Sensitivity assessment of Caligus rogercresseyi to emamectin benzoate in Chile. Aquaculture 2082: 7-12. Cárcamo JG, Aguilar MN, Barrientos CA, Carreño CF, Quezada CA, Bustos C, Manríquez RA, Avendaño-Herrera R, Yañez AJ. 2011. Effect of emamectin benzoate on transcriptional expression of cytochromes P450 and the multidrug transporters (Pgp and MRP1) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and the sea lice Caligus rogercresseyi. Aquaculture 321 (3-4), 201-215. Denholm I., Devine GJ, Horsberg TE, Sevadtal S, Fallang A, Nolan DV, Powell R. 2002 Analysis and management of resistance to chemotherapeutants in salmon lice Lepeophtheirus salmonis (Krøyer) (Copepoda: Caligidae). Pest Management Sciences 58, 528-536. FAO. 2012. El estado mundial de la pesca y acuicultura. Roma, ISSN 1020-5500ISSN http://www.fao.org/docrep/016/i2727s/i2727s.pdf Helgeseen KO, Romstad H, Aaen SM, TE Horsberg. 2014. First report of hydrogen peroxide resistance in salmon lice (Lepeophtheirus salmonis) in Noeway. The 10th International Sea lice Conference, Portland, maine, USA, pag. 85. Horsberg T. 2013. Sea lice treatment and resistance. http://www.sernapesca.cl/index.php?option=com_remository&Itemid=246&func=startdown&id=6420 Revie C, Dill L, Finstad B, Tood CD. 2009. Salmon aquaculture dialogue working group report on sea lice. http://wwf.worldwildlife.org/site/PageNavigator/SalmonSOIForm. SEARCH (QKK2-CT-00809). 2006. Sea lice resistance to chemotherapeutants: A Handbook in resistance management. Sernapesca. 2009. Res. 2117. Programa Sanitario Específico de Vigilancia y Control de la caligidosis (PSEVC-Caligidosis). Sernapesca. 2012 Res. 1141. Establece Programa Sanitario Específico de Vigilancia y Control de la caligidosis (PSEVC-Caligidosis) . http://www.sernapesca.cl/index.php?option=com_remository&Itemid=246&func=fileinfo&id=7263 Sevatdal S,Horsberg TE. 2003. Determination of reduced sensitivity in sea lice (Lepeophtheirus salmonis KrØyer) against the pyrethroid deltamethrin using bioassays and probit modelling. Aquaculture 218, 21-31. Whyte SK, Westcott JD, Elmoslemany A, Hammell KL, Revie CW. 2013. A fixed-dose approach to conducting emamectin benzoate tolerance assessments on field-collected sea lice, Lepeophtheirus salmonis. Journal of Fish Diseases 36, 283-292.