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Rol de los receptores tipo Toll en infección in vitro con Piscirikettsia salmonis en salmón Atlántico y trucha arcoíris

Jaime Figueroa1,2, Denise Haussmann1,2, Matías Muñoz1,2, Alejandro Yañez 1,2, Juan Guillermo Carcamo1,2 y Alex Romero2,3.

1 Instituto de Bioquímica y Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile.

2 Centro Fondap: Interdisciplinary Center for Aquaculture Research (Incar).

3 Instituto de Salud Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Austral de Chile.

 

Introducción

El sistema inmune innato es el primer sistema de defensa contra agentes patógenos en organismos multicelulares. Este sistema es capaz de reconocer características comunes de los patógenos sin requerir una exposición previa o inmunización y los componentes humoral y celular del sistema inmune innato juegan un rol relevante en activar y direccionar la respuesta del sistema adaptativo (Imler y Zheng, 2004). A su vez, los peces teleósteos poseen elementos de ambos sistemas inmunes, sin embargo, tienen diferentes grados de desarrollo con respecto a los mamíferos. Así, el sistema inmune innato posee un set de receptores de reconocimiento de patógenos (Receptores de Reconocimiento de Patrones: PRRs, por sus siglas en inglés) que reconocen patrones propios sólo de los patógenos o PAMPs, activando las diferentes respuestas del sistema inmune innato (Bautista and Mosqueda, 2005). Los más conocidos de estos receptores son los receptores tipo-Toll, o Toll-like receptors (TLRs) y varios de ellos están presentes en peces (Boltaña y col., 2011).

Los TLR son glicoproteínas del tipo I, con una masa molecular entre 90- 115 kDa. Poseen sólo un dominio de transmembrana, un dominio extracelular que contiene varios dominios de regiones ricas en leucina (LRRs). También contienen un dominio intracelular o dominio TIR (Toll/interleukin-1 receptor) (Takano y col., 2010). Todas estas regiones funcionales son claves para el reconocimiento y transducción a una proteína que transmite señales internas en el citoplasma, Myd88. Las diferentes respuestas de los TLR una vez unidos sus ligandos (patógenos), son producidas por la selectividad de cada TLR por ligandos específicos. Por ejemplo, en peces se ha encontrado 17 TLRs (Takano y col., 2010), y una diferencia fundamental con los TLR de mamíferos, es la presencia en peces de un TLR5 soluble en suero que es generado en hígado y que no está presente en mamíferos (Rebl y col., 2010). Adicionalmente, los peces tienen otros TLR que le son propios o carecen de otros que poseen sólo los mamíferos.

Piscirickettsia salmonis es uno de los patógenos que afectan la salmonicultura nacional, especialmente por las mortalidades y pérdidas generadas. Posee diferentes PAMPs que pueden ser reconocidos por diferentes TLRs. Por ello, es crucial estudiar los mecanismos de respuesta de estos TLR en una infección con este patógeno. Por lo tanto, el objetivo central de este trabajo fue clonar y secuenciar los principales TLR presentes en Salmo salar y analizar su expresión en la línea celular SHK-1 de salmón Atlántico y en cultivo primario de leucocitos de riñón anterior de trucha arcoíris, en respuesta a la infección con P. salmonis.

 

Metodología

Se usó secuencias de los TLRs de trucha y se generaron partidores para regiones de consenso. Los productos de PCR fueron clonados, secuenciados, ensamblados y, finalmente, traducidos. La cepa LF-89 (ATCC VR-1361) y la cepa de campo IBM- 040, fueron crecidas en medio Tryptic Soy Broth suplementado, acorde a Vera y col. (2012).

Se usó truchas arcoíris de 0,2 kg, a partir de las cuales se extrajo el riñón anterior. Las células fueron mantenidas en medio L-15, suplementado con Suero Bovino Fetal (FBS, por sus siglas en inglés) 2%. Los leucocitos renales fueron recuperados desde un gradiente continuo de Percoll en PBS. La inactivación bacteriana, fue acorde al procedimiento de Birkbeck y col. (2004). Como control para el procedimiento de infección de la línea celular se usó PBS.

El análisis de expresión efectuado por RT-qPCR con primer obtenido a partir de las secuencias de TLR5M, TLR5S, TLR22, TLR1, TLR9, Myd88, e IL-1?. El efecto de la infección in vitro por P. salmonis fue medido en un estudio cinético por triplicado, a las 2, 12, y 24 horas post infección (hpi), con las diferentes “presentaciones” de la bacteria; bacteria viva, bacteria inactivada por formaldehido y extracto proteico bacteriano. Una vez concluidos los tiempos de incubación, se extrajo el RNA total, se preparó los cDNA y se cuantifico la expresión por qPCR usando el gen EF-1a como normalizador. Los datos fueron evaluados por la formula 2?Ct (sample Ct - normalizer Ct).

La significancia estadística fue determinada a través del valor promedio de 2 muestras en el programa Sigmaplot usando el método t-test (p-values) *<0,05; **<0,01.

 

Resultados

Expresión de TLR en salmón Atlántico

Los TLRs clonados de S. salar (TLR1, TLR22, TLR5M, y TLR5S), mantienen todos los dominios característicos descritos previamente (Fig. 1). Estas secuencias se encuentran depositadas en los bancos de datos: TLR1 (GenBank ID: HQ664666.1), TLR22 (GenBank ID: HQ664669.1), TLR5M (GenBank ID: HQ664667.1) y TLR5S (GenBank ID: HQ664668. 1). El análisis comparativo de las secuencias aminoacídicas de estos receptores con los descritos para trucha arcoíris, revela una alta homología cercana al 90%. Se analizó la expresión de TLR5M, TLR5S, TLR22, TLR1, TLR9, Myd88, e IL-1? in vitro, usando las células SHK-1, incubadas con tres diferentes preparaciones de P. salmonis a diferentes tiempos: Bacteria viva (Fig. 2A); P. salmonis pre-tratada con formaldehido (Fig. 2B); y, finalmente, una preparación de un extracto de la bacteria (Fig. 2C).

Figura 1. Estructura de un TLR. A) En la región extracelular, LRR: Regiones Ricas en Leucina; TM: Región transmembrana; En la región intracelular, dominio TIR (Dominio citoplasmático del receptor IL-1/ Toll). B) Esquema basado en la cristalización del heterodímero TLR1-TLR2 de humano. En verde y rojo representación de los TLR1-TLR2; en rojo ligando sintético para el heterodímero. La unión del ligando promueve la dimerización de los dominios TIR (Adaptada de Jin y col., 2007).
Figura 1. Estructura de un TLR. A) En la región extracelular, LRR: Regiones Ricas en Leucina; TM: Región transmembrana; En la región intracelular, dominio TIR (Dominio citoplasmático del receptor IL-1/ Toll). B) Esquema basado en la cristalización del heterodímero TLR1-TLR2 de humano. En verde y rojo representación de los TLR1-TLR2; en rojo ligando sintético para el heterodímero. La unión del ligando promueve la dimerización de los dominios TIR (Adaptada de Jin y col., 2007).

 

Figura 2. Análisis de expresión de TLRs en una cinética de infección en células SHK-1 con diferentes preparaciones de P. salmonis. (A) P. salmonis viva; (B) P. salmonis inactivada con formaldehido; (C) extracto proteico de P. salmonis. Para cada ensayo cinético se usó un control de células tratadas sólo con el vehículo a las 0 hpi. Las muestras fueron analizadas por triplicado (n=3). (Adaptada de Salazar y col., 2015).
Figura 2. Análisis de expresión de TLRs en una cinética de infección en células SHK-1 con diferentes preparaciones de P. salmonis. (A) P. salmonis viva; (B) P. salmonis inactivada con formaldehido; (C) extracto proteico de P. salmonis. Para cada ensayo cinético se usó un control de células tratadas sólo con el vehículo a las 0 hpi. Las muestras fueron analizadas por triplicado (n=3). (Adaptada de Salazar y col., 2015).

La respuesta de las células SHK-1 a una infección con bacterias vivas reveló una estimulación de la expresión de TLR1, más de 3,5 veces con respecto al control a las 2 hpi. En el caso de TLR22, TLR5M y TLR9, estos TLRs mantuvieron su nivel de expresión con respecto a los controles a las 2 y 24 hpi, pero decae 0,5-, 0,7-, y 0,8-veces a las 12 hpi comparado a los controles. Para TLR5S, se observa una inhibición de la expresión comparado al control para todos los tiempos analizados. En tanto, Myd88 mantiene estable los niveles de expresión en todos los tiempos. Finalmente, IL-1? muestra una estimulación, alcanzando un peak de 6-veces sobre el control a las 12 hpi (Fig. 2A, B, C).

La expresión de los TLR en estudio, cuando se usó una bacteria inactivada, muestra una modulación negativa, al igual que Myd88 e IL1?, dando cuenta de la nula estimulación de los receptores, la molécula mediadora y el efector primario. Por otro lado, las cinéticas de expresión de los TLR en cuestión, usando un extracto proteico de la bacteria, revela que para TLR22, no hay una estimulación. Sin embargo para TLR1, se genera un aumento significativo de la expresión a las 2, 12, y 24 hpi que alcanza niveles de 3, 15, y 30 veces mayores que el control. A su vez, TLR5M y Myd88 mantienen sus niveles de expresión en todos los tiempos. TLR5S muestra un aumento significativo de la expresión alcanzando a 3 y 2 veces mayores que el control a las 12 y 24 hpi. TLR9 muestra aumentos de expresión en todos los tiempos, alcanzando un peak de 7 veces más que el control a las 16 hpi. Finalmente, IL-1? muestra un aumento significativo en su expresión de 12 y 8 veces a las 12 y 24 hpi.

 

Expresión de TLRs en trucha

En los tres TLRs analizados, la cantidad de transcritos durante la infección con la cepa IBM-40 fue significativamente mayor con respecto a la cepa LF-89, pero este aumento sólo se observa a partir de las 6 hpi. Además, a este tiempo se observa el mayor incremento en la cantidad de trascrito detectado (Fig. 3). En la evaluación de la cantidad de transcritos

Figura 3. Expresión relativa por RT-qPCR de TLR1, TLR9, TLR22, Myd88, e IL-1? en cultivo primario de leucocitos de riñón anterior de trucha arcoíris infectados con dos cepas de P. salmonis (n=3).
Figura 3. Expresión relativa por RT-qPCR de TLR1, TLR9, TLR22, Myd88, e IL-1? en cultivo primario de leucocitos de riñón anterior de trucha arcoíris infectados con dos cepas de P. salmonis (n=3).

de MyD88, se observa que estos aumentan desde las 6 hpi y alcanzan un peak a las 24 hpi, lo cual es concordante con la mayor estimulación de los TLRs, alcanzando un aumento de ?60 veces para la cepa IBM-40 (cepa de campo) respecto de la cepa tipo LF-89. En la evaluación de los transcritos de IL-1?, la molécula efectora de la interacción patógeno-TLRs, se aprecia un patrón concordante con Myd88 y la vía de señalización que activa el factor de transcripción NF-?B, que finalmente activa la expresión de IL-1?, descrita en salmonídeos (Ingerslev y col., 2010). El incremento logrado es sostenido desde las 6 hpi, alcanzando un peak a las 24 hpi con la cepa IBM-40. (Fig. 3).

 

Discusión

Investigar el funcionamiento de TLRs en peces dará nuevas luces sobre estrategias relevantes para el desarrollo de sistemas profilácticos contra patógenos. La expresión de estos receptores se modula ante la presencia de los patógenos y genera una serie de moléculas constituyentes de la respuesta inmune innata (Akira y col., 2006). En una bacteria, varios PAMPs pueden ser reconocidos por estos receptores (Underhill y Ozinsky, 2002). Por ejemplo, P. salmonis, al ser una bacteria Gram negativa, contiene lípidos, proteínas y carbohidratos en su membrana que son reconocidos por TLR1 y TLR22. Paralelamente, posee algunos tipos de flagelinas, las que pueden ser reconocidas por TLR5M y TLR5S. A su vez, TLR9 es capaz de reconocer porciones de DNA no-metilado (CpG), característico del genoma de bacterias. Finalmente, IL-1? y Myd88 fueron evaluadas para visualizar la cascada de señalización y la molécula efectora, en respuesta a la unión de ligandos a cada TLR. En el caso de una estimulación con P. salmonis inactivada, los resultados muestran una muy baja o nula expresión de los TLR analizados. Esto sugiere que esta forma de presentar la bacteria a las células no genera una apropiada respuesta inmune, al menos vía los TLR analizados. Probablemente, la inactivación con formaldehido, altera o esconde los patrones moleculares asociados con los patógenos y, por lo tanto, previene la interacción con los TLR.

En tanto, los resultados más interesantes son los que muestran que una forma disgregada de la bacteria (extracto proteico), genera una forma de “presentación” de la bacteria que ayuda a generar una respuesta inmune innata más efectiva. En el caso de TLR1, su ligando específico aún no está claramente determinado en peces (Palti, 2011). Se ha reportado en mamíferos que TLR1 puede formar heterodímeros con TLR2 y es capaz de reconocer peptidoglicano y lipoproteínas bacterianas (Palti, 2011). P. salmonis parece contener algunos PAMPs reconocibles por TLR1, tales como lípidos, proteínas, y carbohidratos expuestos en la membrana. Esto puede coincidir con el aumento significativo de más de 30 veces sobre el control. La infección con P. salmonis modula la expresión de los TLR analizados así como también IL-1? en células de riñón anterior de Salmo salar (SHK-1) y en cultivo primario de leucocitos de riñón anterior de trucha arcoíris. En conclusión, los resultados de este trabajo permiten relacionar el efecto del tipo de cepa bacteriana utilizada sobre la expresión de los TLR e IL-1?. Esto indicaría la necesidad de considerar la patogenicidad de un microorganismo para la evaluación de parámetros inmunológicos del hospedero y también para el desarrollo de vacunas con bacterias atenuadas.

 

Agradecimientos

Innova-Chile (Corfo) 07CN13-IBM-259, Fondecyt 1130069, y Fondap (Incar) N° 15110027.

 

Referencias

Akira, S., Uematsu S. and Takeuchi, O. (2006). Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124, 783-801.

Bautista, C. y Mosqueda, J. (2005). Papel de los receptores tipo Toll en la inmunidad innata y su implicación en medicina veterinaria. Vet. Mex. 36, 453- 468.

Birkbeck, T., Rennie, S., Hunter, D., Laidler, A. y Wadsworth, S. (2004). Infectivity of a Scottish isolate of Piscirickettsia salmonis for Atlantic salmon (Salmo salar) and immune response of salmon to this agent. Disease of Aquatic Organism. 60, 97-103.

Boltaña, S., Roher, N., Goetz, F. and McKenzie, S. (2011), PAMPs, PRRs and the genomics of Gram negative bacterial recognition in fish. Dev. Comp. Immunol.

Jin, M., Kim, S., Heo, J., Lee, M., Kim, H., Paik, S., Lee, H. y Lee, J. (2007). Crystal structure of the TLR1-TLR2 heterodimer induced by binding of a tri-acylated-lipopeptide. Cell. 130, 1071-1082.

Imler, J. and Zheng, L. (2004). Biology of Toll receptors: lessons from insects and mammals. Journal of Leukocyte Biology. 75, 18-26.

Ingerslev, H., Lunder, T., Nielsen, M. 2010. Inflammatory and regenerative responses in salmonids following mechanicals tissue damage and natural infection. Fish Shellfish Immunol. 29, 440-450.

Palti Y. (2011) Toll-like receptors in bony fish: From genomics to functions. Dev. Com, Immunol. 35, 1263– 1272.

Rebl, A., Goldammer, T. and Seyfert, H. (2010). Toll-like receptors signaling in bony fish. Veter. Immuno. and Immunopath. 134, 139-150.

Salazar, C. Haussmann, D., Kausel, G. and Figueroa, J. (2015). Molecular cloning of Salmo salar Toll-like receptors (TLR1, TLR22, TLR5M and TLR5S) and expression analysis in SHK-1 cells during Piscirickettsia salmonis infection. Journal of Fish Diseases. doi:10.1111/jfd.12354.

Takano, T., Hwang, S., Kondo, H., Hirono, I., Aoki, T. and Sano, M. (2010). Evidence of Molecular Toll-like receptors mechanism in teleosts. Fish Pathology. 45, 1-16.

Underhill, D. and Ozinsky, A. (2002). Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Current opinion in immunology. 14, 103-110.

Vera, T., Isla, A., Cuevas, A., Figueroa, J. (2012). A new liquid medium for the pathogen Piscirickettsia salmonis. Arch. Med. Vet. 44: 273-277.