Interactómica: Una herramienta genómica para el desarrollo de nuevas vacunas de última generación contra Caligus rogercresseyi

Resumen

La interacción parásito-hospedero comienza una vez que el parásito identifica a su hospedador. Al iniciar este proceso, el parásito debe liberar una serie de molé- culas que le permitan evadir la respuesta inmune del hospedero y de esta forma infectar. Es por esto que durante miles de años parásitos y hospederos han debido co-evolucionar para lograr la mejor estrategia para infectar, en el caso del parásito, y evadir la infección, en el caso del hospedador. Los procesos de interacción parásito-hospedero aún son escasamente comprendidos, centrándose principalmente en organismos terrestres. De esta forma, distintos estudios se han enfocado en la evaluación de cambios en la respuesta inmune del hospedero, identificando proteasas secretadas por los parásitos y evaluación de la interacción de estas proteínas con las del hospedador. En la actualidad los estudios transcriptómicos derivados de tecnologías de secuenciación masiva, permiten establecer una visión global de las vías de señalización molecular que son alteradas durante la interacción o interactóma parásito-hospedero. La correlación de los perfiles de expresión génica del interactóma, pudiese ser uno de los métodos que permitirían identificar nuevos antígenos para el desarrollo de vacunas de última generación. Sin embargo, conocer sólo como cambia la transcripción de ciertos genes no permite explicar por completo el proceso de interacción. Existen estudios de interacción parásito-hospedero que sugieren que mecanismos post-transcripcionales asociados a miRNA tendrían un rol en este tipo de interacciones, regulando la expresión de genes target. En tanto, a pesar de la creciente información genómica en torno a organismos marinos, aún los estudios de interacción parásito-hospedero en esta área son escasos. El presente trabajo utiliza como modelo de estudio al ectoparásito Caligus rogercresseyi, así como dos especies hospedadoras, salmón Atlántico (Salmo salar) y salmón coho (Oncorhynchus kisutch). Comprender las vías de señalización que participan en la interacción Caligus-salmónido, así como determinar como éstas son reguladas, contribuirían a la comprensión de los procesos de interacción ectoparásito-hospedero en organismos marinos, además de ser una potencial herramienta para el desarrollo de nuevas estrategias de control de este ectoparásito.

Interacción parásitohospedero

Tanto plantas como animales se ven constantemente expuestos a parásitos. La interacción parásito-hospedero es una relación compleja, donde uno de los organismos se ve beneficiado del otro. El parásito, para lograr establecerse en el hospedero debe contrarrestar los mecanismos de defensa de su hospedero [1]. La susceptibilidad o resistencia del hospedador dependerá de la capacidad del parásito de establecerse de manera exitosa o no [1, 2]. La presencia de parásitos genera en el hospedero cambios en su comportamiento, reproducción, regulación de respuesta inmune, entre otros procesos [2]. Durante cientos de años, los parásitos han adquirido múltiples estrategias para evadir los mecanismos de defensa de sus hospederos. De manera paralela, los hospedadores han debido desarrollar estrategias para evadir a los parásitos [3]. Para lograr una infección exitosa, los parásitos deben alterar la expresión de los mecanismos de defensa de sus hospedadores, para lo cual secretan proteínas o péptidos. Por ejemplo, el nemátodo Meloidogynei, que parasita plantas secreta proteasas, superóxido dismutasa, calreticulina, similar estrategia es la que ha sido observa en Trichinella spiralis, nemátodo causante de triquinosis [3]. En el caso de los ectoparásitos, se ha observado que estos liberan proteasas, inhibidores proteasa, y catepsinas, entre otras moléculas, para lograr una infestación exitosa [4].

La mayoría de los estudios de interacción parásito-hospedero se han centrado en comprender la relación entre parásitos terrestres y sus hospederos [4, 5]. En el caso de los organismos marinos, los estudios son limitados. Se sabe que en los peces, condiciones como: edad, comportamiento, fisiología, condición inmunológica, cercanía a la costa, hábitos alimenticios, hábitat pueden afectar en la capacidad infectiva del parásito [1]. Así también, el efecto del parásito sobre el hospedador dependerá de este último, por ejemplo, copépodos como Lernaeocera branchialis, al anclarse en los vasos sanguíneos de las branquias de los peces, generan anemia e incluso mortalidad del pez, dependiendo de la edad del hospedero [1]. Por otra parte, como ya se mencionó, el hábitat de los peces también puede favorecer la presencia de parásitos [6], como es el caso de los copépodo ectoparásitos conocidos como piojo de mar, entre ellos Lepeophtheirus salmonis y Caligus rogercresseyi. Estos ectoparásitos afectan principalmente centros de cultivo de salmónidos, los que se mantienen en altas densidades, asentándose en la piel de su hospedador para obtener alimento, sin producir la muerte del pez, pero favorece el brote de nuevas infecciones al inmuno-deprimir a su hospedador [6-9].

Mecanismos moleculares involucrados en la interacción parásito-hospedero

La interacción parásito-hospedero comienza una vez que el parásito identifica a su hospedador, por lo que conocer las moléculas que interaccionan entre el parásito y hospedero, es la clave para comprender cómo los parásitos logran infectar exitosamente a su hospedero. El conocer el genoma de numerosas especies, ha sido primer paso para comprender las funciones biológicas en torno a la interacción parásito-hospedero [10]. En el caso de los ectoparásitos, éstos al alimentarse de la sangre de su hospedador, en muchos casos deben penetrar la piel de éste, para lo cual liberan una serie de proteasas. Por ejemplo, las garrapatas liberan catepsinas tipo L y serin proteasas (serpinas), inhibidores de tripsinas [4]. En ectoparásitos marinos como Paragnathia formica, se ha observado que existe alta actividad de enzimas como catepsinas, las que parecen ser claves para la digestión de la sangre del hospedero [11]. Otro ejemplo, son los protozoos Ichthyophthirius multifiliis Cryptocaryon irritans, que al adherirse a la piel de los peces secretan proteínas como proteasas (serin, treonin, cistein), catepsina tipo L [12-14]. En relación al copépodo L. salmonis, se ha planteado que una de las estrategias que utiliza para lograr parasitar exitosamente a su hospedero, es mediante la secreción de moléculas que inmunodepriman al pez, como: proteasas, prostagandina sintetasa E2 (PGE2) y catepsinas [15]. En tanto, recientes estudios transcriptómicos realizados en C. rogercresseyi han permitido la identificación de genes como: inhibidores de serpinas [16], catepsinas [17], los que muestran cambios en sus niveles de transcripción a lo largo de los distintos estadios de desarrollo del piojo de mar (Fig. 1).

Durante el proceso infectivo parásito-hospedero, múltiples mecanismos de defensa son activados por el hospedero, dentro de ellos, la respuesta inmune juega un rol primordial. Los peces, así como los mamíferos, poseen un sistema inmune innato que actúa como primera línea de defensa; y un sistema adaptativo, el que a través de la activación de linfocitos T y linfocitos B despliega una respuesta más eficiente y específica a las infecciones. En peces, la respuesta inmune a proteínas foráneas es de menor magnitud que en mamíferos [1]. Algunas de las barreras de defensa de los peces se encuentran en el mucus de la piel, branquias, enzimas digestivas y barreras inmunológicas como respuesta celular y anticuerpos [1].

El sistema inmune innato es un mecanismo de rápida respuesta frente a la presencia de organismos patógenos. El inicio de esta respuesta está dada por el reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) que son reconocidos por receptores reconocedores de patrones (PRRs), los que se pueden encontrar en las membranas celulares o endosomales e, inclusive, en el citoplasma [18, 19]. Dentro de los PRRs, los de mayor relevancia son los Toll-like receptors (TLR), los que se encuentran compuestos por tres dominios: dominio intracelular Toll-interleukin-1 receptor (TIR), región transmembrana y dominio extracelular. El dominio TIR es altamente conservado a lo largo de los TLR, mientras que el dominio extracelular, responsable del reconocimiento de los PAMs, se caracteriza por presentar repeticiones ricas en leucinas (LRR) lo que lo hace altamente variable [18, 19]. En vertebrados, hasta la fecha se han identificado cerca de 21 TLR, los que se distribuyen en seis familias de TLR agrupadas de acuerdo al PAMs que reconocen, estas familias son: TLR1, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7 y TLR11 [20].

En peces, específicamente, se han identificado alrededor de 20 TLR algunos de ellos ortólogos a mamíferos, así como también hay algunos que son específicos para peces, entre ellos: TLR13, TLR19, TLR20, TLR21, TLR22 y TLR23 [21, 22], además de una forma soluble del TLR5 identificado en O. mykiss [23]. En particular el TRL22, pareciera tener un rol en la identificación de moléculas secretadas por los peces luego de ser infestados por ectoparásitos [24]. Ejemplo de ello es la respuesta de Labeo rohita infestados por el ectoparásito Argulus siamensis, en los que luego de la infestación se ha observado una disminución en los niveles de transcritos de TLR22 durante los primeros siete días de infestación, lo que se ha visto revertido luego de 15 dpi [24]. Este incremento de expresión del TLR22, además, se ha relacionado con altas cargas parasitarias en los peces [25]. Adicionalmente, se ha observado que entre Catla catla y L. rohita, este último más susceptible a la infestación por A. siamensis, existe un incremento en los niveles de transcritos de TLR22 en la piel de la especie susceptible, ratificando la hipótesis de la participación de TLR22 en la respuesta a la presencia de ectoparásitos [21]. Así como TLR22 se encuentra asociado con la respuesta a A. siamensis, es posible asociar cambios en los niveles de TLR22 en especies de salmónidos resistentes y susceptibles a C. rogercresseyi (Fig. 2).

Además de la respuesta inmune innata asociada a los receptores TLR, se ha observado que en peces expuestos a ectoparásitos como Cryptocaryon irritans, Ichthyophthirius multifiliis se genera una respuesta inflamatoria presentando incrementos en los niveles de transcritos de genes como interleuquinas (IL)-1ß, IL-8, COX-2, TNF-?, lectina tipo C [26, 27]. En el caso de salmónidos infestados por L. salmonis la respuesta inmune innata, de los peces, ha sido evaluada mediante cambios en los niveles de transcritos de citoquinas pro-inflamatorias como IL-1 ß , IL-1R, IL-12, a demás de TNF- ? y lectinas [28, 29]. Además se ha observado que como mecanismo de respuesta inmune innata los peces incrementan sus niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en respuesta al estrés generado por la presencia de ectoparásitos, lo que se ve reflejado, por ejemplo, en el aumento de la expresión de óxido nítrico sintetasa (iNOS), la cual incrementa los niveles de ROS en O. mykiss infestados por I. multifiliis [27]. Otro ejemplo, es el incremento en los niveles de transcrito de thioredoxin en Oncorhynchus gorbuscha durante la infestacion con L. salmonis [30]. A su vez, el incremento de ROS en peces es posible vincularlo con el incremento de citoquinas pro-inflamatorias, las que son responsables de la producción de ROS [15]. Debido a que el incremento de ROS en la piel de los peces se genera en respuesta a la presencia de ectoparásitos, es posible que C. rogercresseyi incremente los niveles de expresión de genes vinculados al control de ROS como mecanismo de defensa y lograr de esta forma asentarse en el pez (Fig. 3).

El sistema inmune adaptativo de los peces, al igual que en mamíferos, se conforma por linfocitos T y B. Los linfocitos T son los responsables del reconocimiento de antígenos, lo que es mediado por el complejo de histocompatibilidad mayor (MHC), que es activado por citoquinas. Existen dos clases de MHC: MHC I que participa en el reconocimiento de patógenos intracelulares y; MHC II que reconoce patógenos extracelulares [31]. Existen estudios que sugieren un rol de MHC II en respuesta a daños cutáneos en peces, como los causados por la ameba que parasita branquias de los peces (Paramoeba perurans) [32], así también como en salmones por efecto del ectoparásito L. salmonis [33, 34]. El sistema inmune innato y el adaptativo se encuentran ligados, lo que genera un sistema inmune eficiente. En peces, por ejemplo, se han identificado familias de citoquinas mediadores de respuesta Th2 como IL-10 e IL-4 [35]. Particularmente, en salmón coho infestados por L. salmonis, se ha observado la presencia de células MHC II positivas, con morfología típica de aquellas que producen IL-4, acompañado por un incremento en los niveles de transcritos de esta citoquina, lo que sugiere una respuesta tipo Th2 en salmón coho infestados con el ectoparásito [33]. Ligado a esto, en salmónidos infestados por L. salmonis, se ha observado incremento de inmunoglobulina (IgM), anticuerpos generados por linfocitos B, como respuesta a la activación de la respuesta Th2 [28, 29, 35].

Mecanismos posttranscripcionales mediadores de la interacción parásito-hospedero

Si bien los estudios transcripcionales pueden entregar una primera idea de las moléculas que participan en el cross-talk de parásitos y hospederos, es necesario evaluar qué sucede durante los procesos post-transcripcionales y cómo estos son regulados. Dentro de los reguladores del proceso post-transcripcional encontramos los microRNA (miRNA). Estas secuencias no codificantes de 22 nucleótidos aproximadamente, fueron identificadas por primera vez en Caenorhabditis elegans [36], y actúan como reguladoras de la expresión de genes [37]. Los miRNA parecieran tener un rol fundamental en la respuesta inmune, participando en la presentación de antígenos como miR-155 y señalización de linfocitos T como miR181a [38-40], así como otros miRNA que participarían en la diferenciación de linfocitos B y T [38, 40]. En tanto, en mamíferos se ha observado que la vía de respuesta inmune innata, activada por los receptores tipo Toll, no sólo se activan una serie de proteínas, además son activados una serie de miRNA como: miR-155 que promueven la respuesta inmune, miR146a regulador negativo de miR-155, miR-21 que apaga la respuesta inmune [39]. La información relacionada al rol de los miRNA sobre la interacción parásito-hospedero es escasa. Sin embargo, algunos estudios recientes han reportado cambios de expresión de miRNA como miR-184, miR-10 en células de insectos en respuesta a una infección con un virus [41]. En mosquitos afectados por el virus west nile (WNV), se ha observado que existe una disminución de la regulación del miR-2940, miRNA que a su vez reduce la expresión de metaloproteinasas requeridas para la replicación del virus [42]. Otro ejemplo, es el estudio realizado en el los estados larvales 3 y 4 del nematodo Angiostrongylus cantonensis, estados donde parasitan el sistema nervioso de mamíferos. Luego de una secuenciación de miRNA, se encontraron diferencias en el número de miRNA expresados en ambos estados larvales, además de identificar 26 miRNA asociados con la respuesta inmune, los que tendrían un rol fundamental durante el proceso parasítico [43]. Respecto de la regulación de miRNA en peces, se observó en S. salar, que un grupo resistente al virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa (IPNv) presentaba un incremento en los niveles de expresión de miR-4792 en los peces con mayor resistencia, sugiriendo un rol de miR-4792 en la respuesta a INPv en salmónidos [44, 45]. De esta forma, si la presencia de bacterias y virus genera cambios a nivel post-transcripcional alterando la respuesta inmune de sus hospedadores, es posible que el mecanismo de interacción ectoparásito-hospedero se encuentre regulado por miRNA.

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