Evaluación de Seguridad en Agar APS y determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria de Productos Naturales y Aditivos Alimenticios Libres de Antibióticos

Juan Alberto Larraín E., Director Comercial, Ecomarine Research jlarrain@ecomarine.la

A nivel mundial, existe una gran presión e interés de parte de los consumidores por restringir el uso de medicamentos y otros químicos para tratar enfermedades en acuicultura. A su vez, los productores ven con preocupación la posible resistencia generada y el aumento de costos. Actualmente, más del 80% de los antibióticos usados en la industria salmonicultora chilena en fase de agua de mar son para el control de SRS. Para dar soluciones a la industria salmonicultora, la empresa Ecomarine Research del grupo Ecofos, con más de diez años de experiencia en producción de aditivos de origen natural, se ha enfocado en la búsqueda de ingredientes y aditivos como reemplazo al uso de antibióticos, mayoritariamente contra Piscirickettsia salmonis, causante directo de la Septicemia rickettsial salmonídea (SRS).

Antecedentes El tejido intestinal juega un papel central en los efectos inmunológicos de los individuos, debido a que existe un flujo continuo de los derivados de la alimentación y de antígenos microbianos sobre gran parte de la superficie del epitelio intestinal. La abundancia de células inmunes y la suficiente producción de inmunoglobulina, permite que cualquier patógeno invasor sea eliminado rápida y eficientemente del sistema. Sin embargo, es igualmente importante que el sistema inmune intestinal tolere altos niveles de antígenos a diferencia de otros tejidos del cuerpo. Por lo tanto, la respuesta inmunológica en el tejido intestinal tendería hacia la tolerancia a la inflamación. Para los ensayos realizados en salmones, se emplearon una serie de aditivos con resultados comprobados en otras especies marinas y terrestres, las que muestran un incremento de la inmunidad natural de los animales. Los efectos observados en otras especies incluyen incremento de los niveles de inmunoglobulina A (IgA) en el intestino. En tanto, los ensayos han mostrado un aumento del número de macrófagos y linfocitos en los animales aditivados. Todos estos efectos inmunomoduladores han sido, por lo general, acompañados de una mejor salud y productividad de los animales. Uno de los factores más relevantes para tomar la decisión de usar o no aditivos, tiene directa relación con disminuir el factor de conversión alimenticia (FCA), junto con una mejora inmunitaria. En este estudio se ha propuesto determinar cuál o cuales de los aditivos alimenticios que actualmente se utilizan en otras especies, pueden ser una alternativa real al uso de antibióticos frente al SRS, producir una mayor inmunidad y disminuir el factor de conversión alimenticio.

Los productos evaluados son diferentes compuestos naturales, extractos de plantas, aceites esenciales 100% naturales (no sintéticos), mezcla de ácidos orgánicos con compuestos lipofílicos, nucleótidos y péptidos de bajo peso molecular. Se ha demostrado que el sistema inmune responde a diferentes compuestos usados como aditivos a través de muchos tipos de receptores en células, como son los neutrófilos, macrófagos y células dendríticas. La investigación también muestra que los nucleótidos se pueden utilizar para la renovación de las células inmunes y los péptidos de bajo peso molecular tienen correlación con la concentración de IgA en la sangre. IgA se une a la superficie de los microorganismos patógenos, por lo tanto, impide que éstos se fijen al epitelio. Para los animales, las respuestas inmunes provocadas por los anticuerpos pueden ser más seguras que usar la inmunidad innata que normalmente conducen a una inflamación con daño tisular. Por lo tanto, la abundancia de IgA en el epitelio intestinal protege a los animales de manera eficaz contra enfermedades que son energéticamente muy costosas. También ha sido demostrado que niveles altos de IgA en el intestino, se correlacionan positivamente con un mayor crecimiento. Alguno de los productos que estamos probando, han demostrado que estimulan la producción de IgA, que protegen el epitelio intestinal contra agentes patógenos y disminuirían la aparición de inflamaciones locales. Estos efectos mejoran la salud y productividad de los peces. El sistema inmune adaptativo se va desarrollando como una respuesta a los antígenos ambientales. Los aditivos alimenticios que aumentan las reacciones inmunológicas pueden incrementar la tasa de inmunidad, mejorando la salud y productividad. Las células inmunitarias intestinales, como macrófagos y linfocitos CD+, participan en las funciones inmunológicas específicas adquiridas de la mucosa. A mayor cantidad de células disponibles, más rápido y más eficiente será la respuesta inmune. El aumento y abundancia de estas células inmunes en la mucosa intestinal sugiere una mejor inmunidad contra los patógenos (internos y externos).

Los objetivos específicos del estudio son: 1. Medir y evaluar la actividad biológica específica de cada uno de estos productos contra SRS. 2. Determinar y comparar la CIM de once productos naturales diferentes en condiciones estandarizadas. 3. Determinar y comparar la concentración inhibitoria mínima de los once productos para un aislado chileno de P. salmonis de alta patogenicidad.

Hipótesis Los beneficios potenciales para los peces son: 1. Estimular el sistema inmune a nivel intestinal induciendo a una variedad de cambios inmunológicos específicos en beneficio de la salud de los peces, su desempeño y crecimiento. 2. Incremento de la producción de IgA en el intestino como herramienta de protección de los animales contra infecciones energéticamente costosas. 3. Reclutamiento más eficiente de células inmunitarias en el tejido epitelial intestinal. 4. Maduración más rápida del sistema inmune, que conduce a una mejor protección contra los patógenos. 5. Estos efectos inmunomoduladores beneficiosos van por lo general acompañados con una mejor salud y mayor productividad de los cultivos. Metodología Las investigaciones específicas en condiciones in vitro utilizando metodologías estandarizadas se están llevaron a cabo en los Laboratorio Etecma - CIBA. La concentración de los inóculos fue de 0,5 en la escala Mac Farland (108 bacterias/ml, aproximadamente) y se empleó una cepa chilena certificada como de alta patogenicidad. El experimento se dividió en tres fases por producto elegido: etapa de seguridad, CIM y ensayo in vivo infectando a los peces intraperitonealmente con Piscirickettsia salmonis para verificar si el producto es capaz de controlar la patología. Los animales tratados se compararán con testigos de la misma especie. Se realizaron pruebas antagónicas de trece productos contra uno de los patógenos que más afectan los sistemas de cultivo, y de esta forma orientar de una mejor manera a los productores sobre qué producto utilizar en la búsqueda de alternativas al uso de antibióticos y como terapia no farmacológica complementaria al uso de vacunas. En una primera etapa, nombrada como etapa de seguridad, se determinó que productos detenían el crecimiento de la bacteria en el agar y cuál de éstos no cambiaba las condiciones del mismo. Esta primera etapa permitió descartar los primeros dos productos. La segunda etapa consistió en establecer la concentracíon inhibiotoria mínima de cada uno de los aditivos. La tercera fase (aún en desarrollo) consiste en infectar a los peces inoculándolos con el patógeno Piscirickettsia salmonis vía intraperitoneal y mantenerlos en estanques por un período de 30 días, con el objeto de medir la respuesta inmune de los animales. La extracción y estandarización de todos los productos a evaluar en este ensayo está debidamente documentada y cuenta con su respectiva técnica para la caracterización química de los extractos, aceites y diferentes componentes activos.

Resultados Los resultados obtenidos en la primera y segunda etapa son alentadores, ya que diez productos obtuvieron un MIC menor a 0,20%.

Discusión Los productos ensayados mostraron una correcta acción antimicrobiana contra Piscirickettsia salmonis, pero existen factores propios de cada producto como agente antimicrobiano - absorción, distribución, metabolismo, unión a proteínas plasmáticas y otros parámetros- que pueden influenciar la respuesta inmune de los peces y, por lo cual, se hace necesario pasar a una tercera fase de los ensayos. La virulencia del patógeno y la concentración del inóculo en el organismo infectado pueden ser un factor relevante, por lo cual para este estudio se utilizó una metodología estandarizada: la concentración de los inóculos fue de 0,5 en la escala Mac Farland (108 bacterias/ml, aproximadamente) y se empleó una cepa chilena certificada como de alta patogenicidad.

Conclusiones Diez productos de los trece evaluados muestran una correcta acción antimicrobiana, destacándose dos de ellos por tener una concentración mínima inhibitoria menor.

Referencias 1. Bassity E, Clark TG (2012) Functional Identification of Dendritic Cells in the Teleost Model, Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). PLoS ONE 7(3): e33196. doi:10.1371/journal.pone.0033196 2. Natural Poultry Health, A guide to keeping your flock healthy with herbs and other natural products. Maria Groot, RIKILT Tedje van Asseldonk, IEZ Ineke Puls-van der Kamp, IEZ. 3. www.ecofos.cl 4. Palavecino Elizabeth, Universidad Católica de Chile (1999), Boletín Nº 26. 5. Suarez R, Godoy M (2015), Certificado de Patogenicidad cepa Piscirickettsia Salmonis. 6. Godoy M., Suarez R (2015), Evaluación de Seguridad en Agar APS y determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria de productos naturales y aditivos alimenticios libres de antibióticos.